不同均質(zhì)次數(shù)SPI-維生素D3納米粒子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)研究

王喜波 陳 爽 孫立娜 江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

維生素D是人體必需的微量營養(yǎng)素，具有促進(jìn)細(xì)胞生長、分化和對(duì)鈣、磷的吸收等重要作用，還與某些腫瘤、自身免疫性疾病等有關(guān)[1-2]。維生素D3是維生素D的7-位脫氫膽固醇(7-dehydroch-olesterol, pro-vitamin D)的一種結(jié)構(gòu)形態(tài)，在人體內(nèi)經(jīng)不同羥基化后，代謝為1,25-二羥膽鈣化醇(維生素D3的生物活性形式)。維生素D是人體最易缺乏的維生素之一，且這種現(xiàn)象在全球范圍內(nèi)普遍存在[3-4]。維生素D3水溶性差[5]，對(duì)光照敏感，氧、酸性條件，脂肪酸敗等都影響其穩(wěn)定性，因此，維生素D3的利用受到限制。

大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)可以用作生物活性成分的輸送載體，但由于SPI的疏水基團(tuán)絕大部分深埋在內(nèi)部，且結(jié)構(gòu)較緊密，所以與生物活性成分小分子的結(jié)合能力有限。文獻(xiàn)[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)在適度加熱的條件下發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)更加延展，增強(qiáng)了與小分子物質(zhì)間的相互作用。文獻(xiàn)[7]用超聲制備了粒徑分布窄小、具有緩釋功能的酪蛋白-β-胡蘿卜素納米顆粒，有效提高了β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性。高壓均質(zhì)技術(shù)在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[8]，適當(dāng)?shù)母邏壕|(zhì)處理能顯著改善球蛋白的表面疏水性、溶解性、乳化性、柔性及抗氧化性等加工特性[9-11]。在食品行業(yè)，高壓均質(zhì)主要應(yīng)用于乳液制備方面，如文獻(xiàn)[12]采用高壓均質(zhì)制備乳清蛋白乳液，發(fā)現(xiàn)高壓處理可以改變蛋白界面層的結(jié)構(gòu)，同時(shí)改變?nèi)橐毫?，增?qiáng)蛋白質(zhì)在界面上的吸附性和蛋白質(zhì)在界面上的相互作用效果，從而有助于形成比較緊密的界面層和穩(wěn)定性強(qiáng)的乳狀液。但采用高壓均質(zhì)制備SPI-維生素D3納米粒子的研究卻鮮有報(bào)道，本文研究高壓均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的影響，以期為開發(fā)高活性維生素D3產(chǎn)品提供技術(shù)和理論支持。

3.5 病蟲害發(fā)生情況 避雨栽培的無核紅寶石10月25日葉片仍然完好，而露地栽培的葉緣已經(jīng)干枯卷曲。采用避雨栽培后，病蟲害種類發(fā)生變化（見表4），灰霉病、霜霉病、黑痘病基本不發(fā)生，主要病害危害程度和鳥害危害程度都比露地栽培顯著減輕。避雨栽培后，噴藥次數(shù)比露地減少5次，大大減小了病蟲害防控壓力。避雨栽培后，裂果較露地有明顯減少，僅避雨一項(xiàng)措施，就可以將裂果率降到3%以下，如果再結(jié)合地膜覆蓋，避雨栽培就可以解決葡萄裂果問題。

總之，小說教學(xué)是語文閱讀教學(xué)中的重要環(huán)節(jié)，是提高學(xué)生對(duì)文學(xué)的認(rèn)識(shí)、增強(qiáng)對(duì)語文學(xué)習(xí)興趣的重要基礎(chǔ)。因此，教師要努力改變現(xiàn)在小說教學(xué)的尷尬境地，努力研究，采取各種方法，提高語文小說課堂教學(xué)的有效性。

老巴慌成一團(tuán)。他急不擇路地沖過去，蹲下身來扶老婆?；艁y中自己憑著一條腿怎么都站不起身。手臂下老婆的氣息越來越弱。老巴慌了，聲嘶力竭地叫喚，有如荒野中絕望的狼。隔壁左右聽到這聲音，嚇得不輕，都急急奔來。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設(shè)備

維生素D3，純度99%以上，購自Sigma-Aldrich官網(wǎng)。低溫脫脂豆粕，購自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司。甲醇，上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司；1-苯胺基-8萘磺酸鹽(ANS)，天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；試驗(yàn)中所用試劑均為分析純。

AVP-2000型高壓均質(zhì)機(jī)，英國Stansted Fluid Power公司；79-1型磁力加熱攪拌器，金壇市雙捷試驗(yàn)儀器廠；FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；Mastersizer 2000型激光粒徑分析儀，英國Malvern公司；U3000型高效液相色譜儀，美國Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

4） 在工程應(yīng)用中，由于礦化垃圾反應(yīng)床露天作業(yè)、占地面積較大，且礦化垃圾本身又是很好的植物培養(yǎng)土，因此可以考慮在礦化床表面種植綠色植物，并引入蚯蚓、屎殼郎等動(dòng)物，提高床體表面的復(fù)氧能力，通過日益完善的微生物、植物、動(dòng)物復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)一步提高對(duì)尾水的處理效果。

在燕園上班，給我?guī)砹撕芏嗟谋憷旱谝?，我每天上下班不用擠公共汽車，免除了途中勞頓；第二，我能領(lǐng)取一份穩(wěn)定的薪水，解決生存沒有問題；第三，我可以利用北大資源好好學(xué)習(xí)，全面提高自己的學(xué)養(yǎng)。

為避免維生素D3降解，以下操作均在避光條件下進(jìn)行。稱取一定維生素D3粉末溶于無水乙醇，并磁力攪拌以保證其完全溶于乙醇，置于棕色瓶中備用。每次試驗(yàn)前需重新配制維生素D3溶液。

將文獻(xiàn)[13]描述的方法略做改動(dòng)制備SPI，將SPI粉末溶于磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.0)配制成4 mg/mL的SPI溶液，按照SPI與維生素D3質(zhì)量比10∶1將維生素D3溶液加入到SPI溶液中，室溫(20℃)下避光磁力攪拌1 h以制備SPI-維生素D3復(fù)合體系，在100 MPa下均質(zhì)1～4次，得到不同均質(zhì)次數(shù)的SPI-維生素D3納米復(fù)合物。

1.2.2粒徑和ζ-電位測定

用0.01 mol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液將制備的不同均質(zhì)次數(shù)的納米復(fù)合物稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，用Mastersizer 2000型納米粒徑儀檢測納米顆粒的粒徑、多分散性指數(shù)和ζ-電位，測定溫度為25℃，樣品平衡時(shí)間為2 min。

m1——加入維生素D3的質(zhì)量，mg

準(zhǔn)確稱取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品50 mg溶于甲醇并定容至50 mL，配制成1 mg/mL的維生素D3甲醇溶液，再用甲醇將其分別稀釋至質(zhì)量濃度為0.5、0.25、0.01、0.001 mg/mL的標(biāo)液，將各質(zhì)量濃度的標(biāo)液過0.22 μm有機(jī)系濾膜，采用高效液相色譜進(jìn)樣分析，以各標(biāo)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。高效液相色譜分析參數(shù)參照文獻(xiàn)[14]的方法，高效液相色譜檢測器為紫外檢測器，波長為265 nm，所用色譜柱為C18液相柱，檢測時(shí)，柱溫為25℃，流動(dòng)相為甲醇(100%)，流速為1 mL/min。

1.2.4維生素D3包封率和負(fù)載率測定

包封率和負(fù)載率的測定參照文獻(xiàn)[15]的方法并略做改動(dòng)。將10 mg凍干樣品用5 mL甲醇進(jìn)行淋洗，然后用Whatman No 1型濾紙過濾，重復(fù)2～4次，將濾液合并，然后將濾液過0.22 μm有機(jī)系濾膜后用高效液相色譜測定其中維生素D3含量(未結(jié)合維生素D3含量)，將過濾后的粉末凍干并稱量。樣品包封率和負(fù)載率計(jì)算公式為

內(nèi)源熒光光譜測定參照文獻(xiàn)[17]的方法，并略做改動(dòng)，將各樣品分別稀釋至蛋白質(zhì)量濃度0.5 mg/mL，設(shè)定激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長范圍為300～400 nm，狹縫寬度為2.5 nm，電壓700 mV，進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜掃描。

(1)

(2)

式中E——包封率，%

L——負(fù)載率，%

雖然污水處理過程中的回流污泥泵正常運(yùn)行，并且上清液也能夠全部回流，出水氨氮達(dá)標(biāo)，但是總氮依然超標(biāo)。因此，可以將缺氧攪拌全部設(shè)定為反硝化，這樣能夠很好地進(jìn)行脫氮，并控制好出水總氮量，達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1.2.3維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

從業(yè)人員整體素質(zhì)偏低，缺少優(yōu)秀專業(yè)人員，是行業(yè)內(nèi)的一大問題。在如今階段，除了央視廣播電視頻道能夠做到對(duì)信息的實(shí)時(shí)更新和傳播，大多數(shù)地方廣播電視臺(tái)受到節(jié)目播出時(shí)間、技術(shù)落后等各種因素影響，大部分新聞、資訊播出具有延時(shí)性。這樣就非常容易造成在信息反饋給大眾時(shí)，發(fā)現(xiàn)新聞播出，但是信息已發(fā)生變化的現(xiàn)象，這就使新聞報(bào)道失去了真正的意義。

寬甸縣年最低氣溫整體呈周期性變化，如圖3所示。2000、2001年為偏冷期；最高值出現(xiàn)在1995年，為-21.7℃，最低值出現(xiàn)在2001年，為-33.5℃，兩者相差11.8℃。2014—2017年為偏暖期。

m2——未與SPI結(jié)合的維生素D3質(zhì)量，mg

m3——SPI質(zhì)量，mg

1.2.1SPI-維生素D3納米復(fù)合物制備

制造能力是面向云制造的一種重要資源，體現(xiàn)在具體活動(dòng)過程中，反映了制造企業(yè)或制造實(shí)體在制造全生命周期過程中完成某一任務(wù)的能力[8]。針對(duì)制造過程的可持續(xù)制造能力，Zhao等[9]建立了針對(duì)工業(yè)機(jī)器人的可持續(xù)制造能力動(dòng)態(tài)模型；Luo等[10]提出了針對(duì)云制造系統(tǒng)的制造能力多維信息的建模與描述方法；Xu等[11]對(duì)制造設(shè)備能力相關(guān)的信息進(jìn)行了動(dòng)態(tài)建模；Kulvatunyou等[12]提出一種體現(xiàn)供應(yīng)商制造服務(wù)能力的信息模型，并利用基于本體的Web語言提高模型敏捷度。

1.2.8傅里葉紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[14]的方法并稍做修改，將各樣品在紫外-可見分光光度計(jì)600 nm波長下測定其吸光度，所得OD值用來表示濁度，用去離子水作為空白。

1.2.6表面疏水性測定

參照文獻(xiàn)[16]的方法，并略做改動(dòng)。用磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH值7.0)將樣品溶液稀釋到1、0.2、0.04、0.008 mg/mL，然后加入20 μL的ANS(8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸緩沖液，pH值7.0)熒光探針，混合均勻后在室溫下進(jìn)行避光處理，15 min后測定各樣品的熒光強(qiáng)度，設(shè)定激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm，以測得熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以蛋白溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，選擇線性關(guān)系良好的回歸線的斜率作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.2.7內(nèi)源熒光光譜測定

還有“名著管理法”。每學(xué)期初，我要求學(xué)生每人至少準(zhǔn)備一本名著，名人傳記、文學(xué)名著，或成功勵(lì)志書籍都行。我還布置閱讀名著的作業(yè)，讓學(xué)生每天利用課間或課外時(shí)間讀名著，每天閱讀時(shí)間不少于20分鐘；并且每單周抽出一節(jié)語文課作為“名著閱讀課”，專門讓學(xué)生自讀名著，每雙周抽出一節(jié)語文課進(jìn)行“名著秀”，展示或表演讀名著的收獲，對(duì)表現(xiàn)好的予以獎(jiǎng)勵(lì)。

1.2.5濁度測定

CT掃描顯示33例腫瘤邊緣存在清晰界限或局限的病變范圍，其中28例病灶周圍硬化明顯，軟組織未發(fā)生腫塊，5例骨皮質(zhì)變薄但不存在骨膜反應(yīng)。16例腫瘤邊緣模糊，無明顯界限，且周圍軟組織發(fā)現(xiàn)腫塊，存在骨膜反應(yīng)，2例骨皮質(zhì)遭到破壞甚至中斷，并且骨膜反應(yīng)較為明顯。

將1 mg冷凍干燥后的樣品與150 mg KBr粉末混合研磨，然后將混合粉末壓制成固體薄片[18]，使用FTIR-8400S型紅外光譜儀進(jìn)行全波段(4 000～400 cm-1)掃描，設(shè)置分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。采用PeakFit 4.12軟件進(jìn)行擬合分析，通過酰胺Ⅰ區(qū)的反卷積算法計(jì)算不同蛋白樣品中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲成分的含量。

1.2.9SPI-維生素D3納米粒子的光穩(wěn)定性

稱取4 mg維生素D3溶于10 mL去離子水中，取10 mL不同均質(zhì)次數(shù)的樣品，分別置于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中，按以上方法每個(gè)樣品制備9個(gè)，將其水平放置，用15 W的紫外燈近距離(20 cm)照射，每隔30 min取樣一次，每個(gè)樣品取出一個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿取出0.5 mL樣品，測定其中維生素D3含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析(ANOVA)，使用Origin 8.6軟件制圖，PeakFit 4.12軟件計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米粒子粒徑、多分散性指數(shù)和ζ-電位

如圖1所示，經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后，SPI的平均粒徑顯著下降(P<0.05)，均在100 nm以下，平均粒徑由384.33 nm減小至84.77 nm(表1)，同時(shí)隨著均質(zhì)次數(shù)的增加粒徑分布逐漸由雙峰分布轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏宸植?，粒徑分布更加均勻。樣品在?jīng)歷高壓均質(zhì)的過程中，在一定的壓力下，流體被迫通過一些微米孔，流體在通過非常短的距離期間加速到非常高的速度，在經(jīng)受空化、剪切和湍流等作用下，蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，其產(chǎn)生隨機(jī)破裂，解離或解聚，導(dǎo)致粒徑減小[19-21]。在高壓均質(zhì)處理次數(shù)為1～4次的過程中，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，樣品的平均粒徑逐漸減小，在均質(zhì)次數(shù)為2次時(shí)，平均粒徑最小，為84.77 nm，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)繼續(xù)增加時(shí)，平均粒徑和多分散性指數(shù)(PDI)均略有增大，但不顯著(P>0.05)。該結(jié)果可能由于樣品被高壓均質(zhì)次數(shù)過多，反復(fù)經(jīng)受物理作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)重新聚合，粒徑增大[22]。

圖1 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI及SPI-維生素D3納米粒子粒徑分布的影響Fig.1 Effect of high pressures homogenization times on particle size distribution of SPI and SPI-VD3 nano-particles

SPI-維生素D3納米粒子在經(jīng)歷0～4次高壓均質(zhì)處理后，粒徑變化趨勢與SPI經(jīng)受高壓均質(zhì)后粒徑變化相同，平均粒徑由145.20 nm減小至82.00 nm。在經(jīng)受相同次數(shù)的高壓均質(zhì)條件下，SPI-維生素D3納米粒子與SPI相比有更小的粒徑，這也說明維生素D3與SPI相互作用后使復(fù)合物結(jié)合更加緊密。

由表1可知，SPI與SPI-維生素D3納米粒子均帶負(fù)電荷，有效的表面電荷主要決定懸浮顆粒的分散和聚集，更多的表面負(fù)電荷使顆粒之間的靜電排斥增強(qiáng)，可以使膠體聚集體破壞并防止進(jìn)一步聚集[23-24]。樣品經(jīng)受高壓均質(zhì)處理后，電位的絕對(duì)值略有減小，當(dāng)高壓均質(zhì)3次和4次后，電位的絕對(duì)值顯著減小，該結(jié)果可歸因于蛋白變性和聚集的形成。

表1 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子粒徑、PDI、ζ-電位的影響Tab.1 Effect of high pressure homogenization times on particle size, PDI, ζ-potential of SPI-VD3 nano-particles

2.2 納米粒子負(fù)載率和包封率

在SPI-維生素D3納米粒子制備過程中，許多參數(shù)都會(huì)影響SPI-維生素D3納米粒子的性質(zhì)和負(fù)載率和包封率，表2中體現(xiàn)了均質(zhì)次數(shù)對(duì)負(fù)載率和包封率的影響。未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的SPI-維生素D3樣品的負(fù)載率為62.00%，包封率為6.20%，即維生素D3負(fù)載量可達(dá)到62.0 μg/mg，均質(zhì)壓力為100 MPa、均質(zhì)次數(shù)為2次時(shí)，負(fù)載率和包封率顯著提高，負(fù)載率達(dá)到79.21%，包封率達(dá)到7.92%，與未均質(zhì)樣品相比提高了27.7%，這歸因于微通道中剪切、撞擊和空化等作用使SPI表面疏水性變化從而使更多的維生素D3可以和SPI疏水基團(tuán)發(fā)生作用[25]。文獻(xiàn)[26]指出氫鍵和弱分子間作用力可以在均質(zhì)作用下斷裂從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，暴露出更多疏水基團(tuán)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)均質(zhì)次數(shù)達(dá)到3次后包封率和負(fù)載率均有所下降。本團(tuán)隊(duì)在之前的研究中發(fā)現(xiàn)SPI與維生素D3結(jié)合為非共價(jià)結(jié)合，主要作用力為疏水相互作用和靜電相互作用[27]，均質(zhì)次數(shù)較多時(shí)，強(qiáng)的剪切、湍流等作用對(duì)已經(jīng)結(jié)合的SPI-維生素D3的非共價(jià)鍵產(chǎn)生了破壞。在高壓均質(zhì)過程中，一方面改變SPI的結(jié)構(gòu)，提高其與維生素D3的相互作用，另一方面，過強(qiáng)的高壓均質(zhì)破壞SPI與維生素D3之間的非共價(jià)鍵而不利二者結(jié)合。文獻(xiàn)[28]在研究高壓均質(zhì)壓力對(duì)SPI-維生素D3納米復(fù)合物影響時(shí)得到了同樣的結(jié)論。

表2 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子負(fù)載率和包封率的影響Tab.2 Effect of high pressure homogenization times on EE and LE of SPI-VD3 nano-particles %

2.3 納米粒子濁度

由圖2(圖中相同參數(shù)不同字母表示差異顯著，下同)可見，由于未均質(zhì)的SPI樣品和SPI-維生素D3體系中存在大量沉積在底部的高分子聚合物，導(dǎo)致體系濁度較大；經(jīng)過高壓均質(zhì)的強(qiáng)剪切力和空化的作用力后，大的蛋白聚集體分散成小的亞基，使溶液中小聚集體數(shù)量增多，進(jìn)而使?jié)岫葴p小，該結(jié)果也可能與蛋白的溶解度有關(guān)，高壓均質(zhì)改變蛋白結(jié)構(gòu)，增大其在水中的溶解性，從而使?jié)岫葴p小。文獻(xiàn)[14]研究發(fā)現(xiàn)未被處理的SPI溶液呈現(xiàn)低溶解度、高濁度，經(jīng)過超聲空化作用處理后蛋白溶解性顯著提高，濁度降低。當(dāng)均質(zhì)3、4次時(shí)，濁度不再減小，反而略有提高，這可能是因?yàn)榻怆x的小分子重新聚集。

圖2 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子濁度的影響Fig.2 Effect of high pressure homogenization times on turbidity of SPI-VD3 nano-particles

2.4 納米粒子表面疏水性

圖3顯示了SPI與SPI-維生素D3納米粒子經(jīng)過不同次數(shù)高壓均質(zhì)處理后的表面疏水性的變化。均質(zhì)0～3次時(shí)，SPI的表面疏水性指數(shù)顯著提高(P<0.05)，由1 134.8增大到1 537.2。該現(xiàn)象主要是由于高壓均質(zhì)可以對(duì)蛋白的大聚集體進(jìn)行破壞，使蛋白結(jié)構(gòu)更加伸展，深埋在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于外部[29]。SPI-維生素D3的表面疏水性指數(shù)也隨高壓均質(zhì)次數(shù)增大呈現(xiàn)出增大的趨勢，但其表面疏水性指數(shù)均低于單純的SPI，該結(jié)果可能因?yàn)榫S生素D3與蛋白疏水基團(tuán)相互作用使表面疏水性降低，文獻(xiàn)[30]研究維生素D3與β-乳球蛋白相互作用時(shí)指出維生素D3可能通過蛋白表面的疏水基團(tuán)與其結(jié)合。適當(dāng)?shù)木|(zhì)次數(shù)可以有效地增大樣品的表面疏水性，而次數(shù)過多可能會(huì)使已經(jīng)打開的蛋白結(jié)構(gòu)重新聚合，由圖3可知，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)為3次和4次時(shí)，高壓均質(zhì)已經(jīng)不再顯著改善表面疏水性，反而可能對(duì)蛋白產(chǎn)生了不利的影響。蛋白質(zhì)-生物活性成分納米復(fù)合物是基于蛋白質(zhì)與(難溶)生物活性物質(zhì)之間的疏水相互作用而構(gòu)建的納米輸送載體，疏水作用是一種熵驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過程，活性物質(zhì)與蛋白的疏水位點(diǎn)接觸的可能性是兩者相互作用發(fā)生的關(guān)鍵，本試驗(yàn)采用高壓均質(zhì)法改變蛋白表面疏水性進(jìn)而提高負(fù)載量。

圖3 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子表面疏水性指數(shù)的影響Fig.3 Effect of high pressure homogenization times on surface hydrophobicity of SPI-VD3 nano-particles

2.5 納米粒子內(nèi)源熒光光譜

固定激發(fā)波長290 nm，掃描不同均質(zhì)次數(shù)處理后樣品的內(nèi)源熒光光譜。從圖4可以看出，與未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的樣品相比，樣品經(jīng)高壓處理后，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，更多的色氨酸殘基被暴露。熒光強(qiáng)度與均質(zhì)次數(shù)不完全呈正相關(guān)關(guān)系，高壓均質(zhì)使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而維生素D3的存在可能使蛋白結(jié)構(gòu)改變，發(fā)色基團(tuán)色氨酸的微環(huán)境發(fā)生變化，進(jìn)而改變其對(duì)熒光的敏感程度，使熒光強(qiáng)度降低。當(dāng)內(nèi)部色氨酸被其他構(gòu)象遮蔽時(shí)也會(huì)使蛋白熒光發(fā)生猝滅[31]。

圖4 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.4 Effect of high pressure homogenization times on surface fluorescence spectroscopy of SPI-VD3 nano-particles

2.6 納米粒子傅里葉紅外光譜

圖5 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子傅里葉紅外光譜的影響Fig.5 Effect of high pressure homogenization times on surface Fourier infrared spectroscopy of SPI-VD3 nano-particles

表3 不同均質(zhì)次數(shù)下SPI-維生素D3納米粒子中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Tab.3 Effect of high pressure homogenization times on protein secondary structure in SPI-VD3 nano-particles %

2.7 納米粒子光穩(wěn)定性

文獻(xiàn)[36]提出維生素D3的光穩(wěn)定性較差，維生素D3及不同高壓均質(zhì)壓力下制備的各SPI-維生素D3納米粒子被放置于15 W的紫外燈下照射，各樣品中維生素D3的降解情況如圖6所示。維生素D3在水中降解較快，在紫外燈下照射4 h后，僅剩余18%，而與SPI發(fā)生相互作用后，維生素D3的光穩(wěn)定性明顯提高，這可能因?yàn)榇蠖沟鞍字械姆枷阕辶u基和雙鍵可吸收紫外線，從而降低紫外線強(qiáng)度，達(dá)到保護(hù)維生素D3的作用[37]。均質(zhì)壓力為0 MPa時(shí)樣

品在4 h紫外照射后維生素D3剩余24%，隨著均質(zhì)次數(shù)的增多，樣品的光穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)為2次時(shí)，維生素D3質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到48%，與未均質(zhì)樣品相比提高了166.6%，SPI-維生素D3納米粒子的光穩(wěn)定性得到改善。該結(jié)果表明適當(dāng)?shù)母邏壕|(zhì)能促進(jìn)SPI與維生素D3的結(jié)合，達(dá)到更好保護(hù)維生素D3的作用。

圖6 均質(zhì)次數(shù)對(duì)SPI-維生素D3納米粒子光穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of high pressure homogenization times on light stability of SPI-VD3 nano-particles

3 結(jié)束語

適當(dāng)?shù)母邏禾幚砟軌蛱岣逽PI-維生素D3納米粒子的性質(zhì)。當(dāng)高壓均質(zhì)壓力為100 MPa、高壓均質(zhì)次數(shù)為2次時(shí)，制備的SPI-維生素D3納米粒子的平均粒徑由145.20 nm減小至82.00 nm，濁度減小，體系更均一；包封率和負(fù)載率較高，分別為79.21%和7.92%，負(fù)載率提高了27.7%；SPI及SPI-維生素D3納米粒子的表面疏水性均增大，有利于SPI與維生素D3的結(jié)合；內(nèi)源熒光光譜和傅里葉紅外光譜表明，高壓均質(zhì)使復(fù)合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋和β-折疊逐漸轉(zhuǎn)變成β-轉(zhuǎn)角；高壓均質(zhì)處理使SPI-維生素D3納米粒子的光穩(wěn)定性顯著提高，與純維生素D3相比，紫外燈下照射4 h后維生素D3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由18%提高至48%，提高了166.6%。本文認(rèn)為，SPI-維生素D3納米粒子負(fù)載率的提高及光穩(wěn)定性的改善與SPI結(jié)構(gòu)展開、疏水基團(tuán)暴露有一定關(guān)聯(lián)。