蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)控的研究進(jìn)展

茹 磊，王麗巖，王 超，李永新

（渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121013）

0 引言

蔗糖是碳水化合物運(yùn)輸?shù)闹饕问剑怯晒夂献饔迷谌~片的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生，然后通過韌皮部運(yùn)輸?shù)劫A藏組織 “庫” （根、莖、生殖器官等）中，為植物的生長發(fā)育提供能量.此外，研究發(fā)現(xiàn)蔗糖也可作為信號分子，與植物激素赤霉素［1］、乙烯［2］、茉莉酸［3］以及氮元素［4］的信號通路相互作用，影響植物的生長、組織分化、器官發(fā)育、開花結(jié)果等過程.

蔗糖是一種雙糖，而植物可以直接利用的大多是單糖，因此蔗糖分解代謝對于植物的生長發(fā)育至關(guān)重要.蔗糖分解過程主要依靠蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SUS）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）這兩類酶.SUS參與的反應(yīng)是可逆的且以合成蔗糖為主，而INV則是不可逆地將蔗糖分解為葡萄糖和果糖.在裂解蔗糖的過程中，INV比SUS發(fā)揮的作用更為重要［5］.

目前研究表明，INV在植物生長發(fā)育、逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用.同時(shí)INV活性在mRNA水平和翻譯后水平受到精密的調(diào)控.本文主要總結(jié)了近年來植物中有關(guān)INV活性調(diào)控的研究進(jìn)展，以期為研究調(diào)控INV活性的機(jī)制以及INV在植物抗逆應(yīng)用上提供新思路.

1 蔗糖轉(zhuǎn)化酶的分類及數(shù)目

根據(jù)其亞細(xì)胞定位和最適pH值，INV可分為酸性細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（Cell wall invertase，CWIN）、酸性液泡轉(zhuǎn)化酶（Vacuolar invertase，VIN）和中/堿性細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（Cytoplasmic invertase，CIN），其中VIN和CIN是可溶性的，CWIN是不溶性的.

CWIN被認(rèn)為有卸載蔗糖的作用，通過水解質(zhì)外體中的蔗糖以降低蔗糖濃度，從而使韌皮部的蔗糖順濃度梯度轉(zhuǎn)移到質(zhì)外空間中去.除此之外，CWIN還有防御病毒［6］和促進(jìn)果實(shí)生長［7］的功能.最近的研究表明，提高CWIN的活性也會對種子的發(fā)育起到抑制作用［7］，但出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因有待于進(jìn)一步的研究.VIN在糖積累和細(xì)胞伸長方面起重要作用，VIN可將蔗糖轉(zhuǎn)化為己糖，一方面為細(xì)胞的生長提供能量來源，另一方面通過調(diào)節(jié)滲透壓來促進(jìn)細(xì)胞的伸長.因此，在植物的快速擴(kuò)張部位都有著較高的VIN活性［8］，這已在小麥（Triticum aestivumL.）、馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）、棉花（Gossypium hirsutumL.）以及玉米（Zea maysL.）等植株上得到驗(yàn)證［9］.對于CIN生理功能的研究相對較少，可能是因?yàn)榕c高糖基化的CWIN和VIN相比，CIN的穩(wěn)定性和活性較低［10］.但已有研究表明CIN在根系細(xì)胞發(fā)育和生殖過程中是不可缺少的［11-12］.

表1 多種作物中的INV基因家族成員

編碼不同作物的INV的基因數(shù)量不同，CIN比CWIN和VIN擁有更多的基因成員，而編碼CWIN和VIN的基因數(shù)量相差無幾.研究者已在擬南芥中鑒定出4個(gè)編碼CWIN（AtCWINV1、AtCWINV 2、AtCWINV 4、AtCWINV5），2個(gè)編碼VIN（AtVIN1、AtVIN2）以及9個(gè)編碼CIN（At-A/N-InvA～At-A/N-InvI）的基因成員［13?15］；在楊樹中也發(fā)現(xiàn)了5個(gè)編碼CWIN（PtCIN1～PtCIN5）、3個(gè)編碼VIN（PtVIN1～PtVIN3）以及16個(gè)編碼CIN（PtNIN1～PtNIN16）的基因［16］.隨著植物基因組測序的不斷完善，研究者利用生物信息學(xué)在全基因組范圍內(nèi)對INV基因家族進(jìn)行預(yù)測和分析，從而在更多高等植物中鑒定出INV的基因成員，如棉花、辣椒的部分INV基因成員分別以擬南芥和番茄的INV基因?yàn)閰⒖夹蛄?，再通過數(shù)據(jù)庫比對篩選而得來的［15，17］.目前已經(jīng)在多種作物中鑒定出編碼INV的基因，如茶樹（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）、番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）、馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）、擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）等（表1）.

2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的調(diào)控

INV酶活性水平在植物體內(nèi)受到精密調(diào)控，主要體現(xiàn)在mRNA水平和翻譯后水平［38］.糖分、激素、生物和非生物脅迫等在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性.蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制子（INV inhibitor，INVINH）、N-糖基化、磷酸化等則是在翻譯后水平調(diào)控INV的活性.此外，缺陷型蔗糖轉(zhuǎn)化酶（defective INV）也可能參與INV活性的翻譯后調(diào)控［39］.

2.1 mRNA水平的調(diào)控

蔗糖作為植物體最主要的碳和能量來源，在植物體內(nèi)有著一系列與激素等在代謝通路和信號通路的互作機(jī)制，保障植物體在多樣的環(huán)境下的生命活動.蔗糖作為INV酶解反應(yīng)的底物通常會促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，而葡萄糖作為產(chǎn)物則會起到反饋抑制作用.然而，不同組織間甚至同一INV基因家族中的不同基因，對糖分的響應(yīng)卻不相同.研究發(fā)現(xiàn)，175 mmol/L的蔗糖或甘露醇處理蔗糖處理水稻后，顯著提高了OsCIN1的轉(zhuǎn)錄水平，卻下調(diào)了OsCIN5的轉(zhuǎn)錄水平.對于未成熟的穎果，蔗糖僅顯著誘導(dǎo)OsCIN2的表達(dá)，OsCIN1、OsCIN4和OsCIN7的表達(dá)未受到影響［40］.在番茄［21］、擬南芥［41］中的研究中也發(fā)現(xiàn)了葡萄糖對INV基因有相反的調(diào)控作用，但這種雙向調(diào)控是如何起作用的還需進(jìn)一步研究.激素也會對INV基因的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生影響，如生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素及油菜素內(nèi)酯通過信號或代謝相關(guān)途徑誘導(dǎo)CWIN基因表達(dá)，已經(jīng)在多種作物中［42?43］得到了證實(shí).這可能是由于大多數(shù)情況下激素介導(dǎo)的生長響應(yīng)會增加植物組織對碳水化合物的需求，所以生長激素可以通過與糖的互作來調(diào)控INV.值得一提的是，脫落酸受作物品種、組織器官、發(fā)育階段以及外部環(huán)境等不同因素的影響，對INV起不同的調(diào)控作用［44?45］.除此之外，當(dāng)植株受到脅迫時(shí)，INV的表達(dá)也會受到影響.Rosenkranz等［46］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甜菜根受到機(jī)械損傷后，CWI-1和VI-1的mRNAs顯著上調(diào).其他環(huán)境脅迫，如干旱［47］、冷脅迫［48］、鹽脅迫［49］、低氧［50］等逆境，可能會導(dǎo)致激素、ROS和碳氮代謝等通路發(fā)生改變，從而通過復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)對INV基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控.

2.2 翻譯后水平的調(diào)控

2.2.1 N-糖基化

在植物中，VIN和CWIN具有N-糖基化的修飾過程，即在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，受體蛋白的天冬酰胺（Asn）殘基連接一條多糖鏈的過程［51］.Tauzin等［52］通過定點(diǎn)突變的方式研究了四個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（Asn52、Asn119、Asn184和Asn516）在VIN中的功能作用，結(jié)果表明這四個(gè)糖基化位點(diǎn)的缺失會影響VIN蛋白的折疊，使VIN熱穩(wěn)定性和活性下降，甚至直接導(dǎo)致VIN失活.此研究結(jié)果也證明了N-糖基化對調(diào)控INV酶活性至關(guān)重要.

2.2.2 磷酸化

目前，人們已發(fā)現(xiàn)CIN活性在翻譯后受到蛋白磷酸化水平的調(diào)控.Gao等［53］報(bào)告了一種影響CIN活性的機(jī)制，AtCINV1蛋白C末端的Ser547是鈣依賴性激酶（CPK3和21）的底物，其磷酸化后可成為14-3-3蛋白的高親和力位點(diǎn)，使AtCINV1與14-3-3蛋白結(jié)合，并在光誘導(dǎo)下顯著增強(qiáng)根系中的CIN活性，為植物的晝夜生長提供代謝基礎(chǔ).此外，前人研究表明磷脂酰肌醇磷酸5-激酶（PIP5K9）可負(fù)調(diào)控?cái)M南芥根細(xì)胞中的CIN（AtCINV1）的活性，以抑制根的生長［54］.AtPIP5K9可能通過干擾14-3-3蛋白與AtCINV1的C末端的結(jié)合，從而影響AtCINV1的磷酸化，導(dǎo)致CIN的酶活性降低［53］.

2.2.3 蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)

VIN是一種可溶性液泡分泌蛋白，其含有一個(gè)由基本結(jié)構(gòu)域和跨膜域組成的氨基端肽段（NTPP）［55］，研究發(fā)現(xiàn)VIN與酵母的堿性磷酸酶NTPPs存在同源性，這表明VIN可能同酵母的堿性磷酸酶采用同一種跨膜蛋白的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中［51］.在擬南芥中，AtFRUCT4已經(jīng)被證明是由前體蛋白酶囊泡（PPVs）和降解液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶的液泡處理酶（VPEY）的協(xié)同作用所調(diào)控的，PPV可延長AtFRUCT4向液泡傳遞的時(shí)間，并且其儲存的不活躍的VPEG蛋白酶可與AtFRUCT4一起釋放到液泡中，隨后靶向并降解衰老組織中的VIN蛋白［56］，從而調(diào)控VIN的水解活性.

2.2.4 糖信號誘導(dǎo)

大量研究已表明糖信號可通過誘導(dǎo)植物中INV基因的表達(dá)而對INV活性起調(diào)控作用.王永章和張大鵬卻提出果糖和葡萄糖還可以誘導(dǎo)蘋果中的CWIN和VIN活性在翻譯后水平的抑制調(diào)節(jié)［57］.研究發(fā)現(xiàn)，在蘋果發(fā)育過程中，CWIN活性逐漸下降，但該酶的蛋白數(shù)量逐漸上升，并據(jù)此推測CWIN的mRNA的翻譯量也應(yīng)是上升的.他們通過添加外源糖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，排除了抑制子和化學(xué)反應(yīng)平衡導(dǎo)致的己糖抑制的可能，認(rèn)為是果糖和葡萄糖誘導(dǎo)有關(guān)抑制基因表達(dá)或修飾酶的結(jié)構(gòu)對INV活性進(jìn)行調(diào)節(jié)［57］.但實(shí)驗(yàn)未對INV基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測，不夠嚴(yán)謹(jǐn)，且果糖和葡萄糖在翻譯后水平調(diào)控的機(jī)制仍需進(jìn)一步確定.

2.2.5 蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白

INVINH是一種小分子蛋白，其分子量在15～23 kD之間.Hothorn等［58］通過分析擬南芥中的INV1和其抑制劑CIF之間復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)CIF中存在一個(gè)針對INV1的活性位點(diǎn)的氨基酸基序.在該位點(diǎn)，CIF與蔗糖競爭性地與INV結(jié)合.INVINH通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作方式與其INV的活性區(qū)域結(jié)合，從而阻礙了蔗糖分子與INV結(jié)合，對調(diào)控INV的活性起重要作用.

目前僅發(fā)現(xiàn)CWIN、VIN存在對應(yīng)的抑制蛋白CWIN抑制蛋白（CWIN-INH）和VIN抑制蛋白（VININH），這可能是由于酸性INV因糖基化修飾比較穩(wěn)定，其活性很大程度上依賴于翻譯后的調(diào)控［59］.為了確定INV在植物功能中是否受相應(yīng)的抑制子翻譯后的控制，Jin等［45］通過沉默CWIN抑制蛋白INVINH1構(gòu)建了RNAi番茄植株，發(fā)現(xiàn)其營養(yǎng)和生殖器官中的CWIN活性提高，葉片衰老延遲，種子和果實(shí)的重量也均增加；而過度表達(dá)則抑制發(fā)育.這證明了INVINH能夠調(diào)節(jié)CWIN的活性，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育.Rausch等［59］克隆了NtCIF（CWIN-INH）和NtVIF（VIN-INH），并在大腸桿菌中以his標(biāo)記的重組蛋白形式表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)CWIN-INH對VIN和CWIN酶的活性都有抑制作用，而VIN-INH具有特異性.

研究者將煙草蔗糖轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白（NtINVINH1）在馬鈴薯中過量表達(dá)降低了VIN活性，并顯著減少低溫貯藏條件下馬鈴薯還原糖的累積以及口感變甜［60］.還有研究表明馬鈴薯中的StvacINV1不僅受其抑制子StInvInh2B翻譯后水平調(diào)節(jié)，二者還可與SbSnRK1形成復(fù)合體SbSnRKI-StvacINV1-StInvInh2B，從而對低溫脅迫下的INV活性進(jìn)行調(diào)控［51］.

2.2.6 缺陷型轉(zhuǎn)化酶

INV酶家族中不具有正常INV酶活性的假酶，被稱為缺陷型蔗糖轉(zhuǎn)化酶.現(xiàn)在，缺陷型蔗糖轉(zhuǎn)化酶已被發(fā)現(xiàn)存在于甜菜（Beta vulgaris L.）、水稻（Oryza sativa L.）、玉米（Zea mays L.）、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）、菊苣（Cichorium intybus L.）等多種作物中.Wan等［23］在四種高等植物中發(fā)現(xiàn)，近一半的酸性轉(zhuǎn)化酶因NDPN基序殘缺而無法水解蔗糖.

煙草（Nicotiana tabacum）中的Nin88基因，之前被認(rèn)為是具有正常CWIN功能的基因，但研究發(fā)現(xiàn)Nin88的Trp47和Asp239處分別存在色氨酸-蛋氨酸、天冬氨酸-脯氨酸突變，導(dǎo)致了其水解蔗糖能力的喪失［39］.體外實(shí)驗(yàn)表明Nin88可能通過與具有活性的INV或INVINH競爭性結(jié)合細(xì)胞壁，增強(qiáng)或降低轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖的活性而具有調(diào)節(jié)INV活性的作用［39］.在擬南芥中，存在兩個(gè)淀粉酶（β-amylase-like），其降解淀粉的活性很低甚至完全喪失，但是這兩個(gè)缺陷型淀粉酶可作為轉(zhuǎn)錄因子，通過和油菜素甾醇互作來調(diào)節(jié)擬南芥生長發(fā)育［61］.因此，缺陷型酶雖不具有正常的催化功能，但可能參與調(diào)節(jié)正常酶活性，或者參與細(xì)胞間信號傳遞.

3 展望

植物的生長發(fā)育與糖代謝和累積密不可分，而蔗糖代謝和碳水化合物分配受INV調(diào)控.由此可見，INV在植物生長發(fā)育上有著舉足輕重的作用.隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，INV的基因、結(jié)構(gòu)以及功能的研究都取得了很大進(jìn)展，但仍存在一些疑惑，亟待解決.CIN是否還具有其他生理功能，Defective INV是否參與調(diào)控INV活性翻譯后水平調(diào)控，Defective INV和INVINH是否共同調(diào)控INV活性，闡明調(diào)控INV活性的精細(xì)調(diào)控，有利于改善植物抗逆性，促進(jìn)植物生長發(fā)育，以保障作物的高產(chǎn)量和高品質(zhì).