CB 微核法人體外周血淋巴細(xì)胞檢測在全自動微核掃描分析系統(tǒng)上的應(yīng)用

陳 洋 邱海源 朱曉穎 馬 沖 戴世堯

（廣東省惠州市職業(yè)病防治院 廣東惠州 516001）

1 前言

阻斷微核法（CB 微核法）是在細(xì)胞進(jìn)入第一次有絲分裂前，向培養(yǎng)液中加入能阻斷胞質(zhì)分裂但不影響細(xì)胞核分裂的胞質(zhì)分裂劑—松胞素-B（Cyt-B）的方法，Cyt-B 可以使細(xì)胞有絲分裂為特殊形態(tài)的雙核細(xì)胞，未發(fā)生細(xì)胞核分裂的細(xì)胞則會維持單核細(xì)胞形態(tài)。

通過檢測致突變因素作用后的雙核細(xì)胞的微核細(xì)胞率和雙核細(xì)胞微核率，可同時獲得致突變因素對細(xì)胞的遺傳毒性損害和對細(xì)胞周期的影響[1-6]。 本文分析了CB 微核法試驗在全自動微核掃描分析系統(tǒng)上的應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 對象

近期無明顯用于診斷和治療的醫(yī)療照射史和化學(xué)接觸史，不吸煙25 歲健康男性志愿者5 名。

2.2 材料與設(shè)備

材料：注射用環(huán)磷酰胺：用規(guī)格為0.2 g 的生理鹽水配成20 mg/mL，置于冰箱4℃保存；Cyt-B：先溶于二甲基亞砜（DMSO）中，于-20℃保存，用前融化，用生理鹽水稀釋成300 μg/mL；固定液：甲醇∶乙酸=3∶1。

設(shè)備：RPMI 1640 培養(yǎng)基；MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)；AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)；生物顯微鏡。

2.3 CB 法微核試驗樣本的制備

取0.5 mL 靜脈血中加入4 mL 經(jīng)不同濃度環(huán)磷酰胺處理過的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，混勻，37℃恒溫培養(yǎng)40 h 加300 μg/mL Cyt-B，終濃度為6 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)至70 h 后終止培養(yǎng)。將培養(yǎng)基倒入15 mL 尖底離心管中，1 200 r/min 離心7 min，吸去上清液加入4 mL 0.075 mol/L 氯化鉀低滲溶液，混勻靜置1 min后加入1 mL 固定液，1 200 r/min 離心7 min，去上清液后加入固定液8 mL，混勻靜置20 min，1 200 r/min離心7 min，去上清液后再次加入5 mL 固定液固定20 min，1 200 r/min 離心7 min，去上清液，余下0.5 mL混勻制成細(xì)胞懸液，滴片，氣干，Giemsa 染色。 觀察到的細(xì)胞大部分即為處于第一次有絲分裂時期的雙核淋巴細(xì)胞。

2.4 常規(guī)培養(yǎng)法微核試驗的樣本制備

取0.5 mL 靜脈血中加入4 mL 經(jīng)不同濃度環(huán)磷酰胺處理過的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，混勻，37℃恒溫培養(yǎng)72 h 后終止培養(yǎng)。將培養(yǎng)基倒入15 mL 尖底離心管中，1 200 r/min 離心7 min，吸去上清液加入4mL 0.075 mol/L 氯化鉀低滲溶液， 混勻靜置1 min 后加入1 mL 固定液，1 200 r/min 離心7 min， 去上清液后加入固定液8 mL， 混勻靜置20 min，1 200 r/min 離心7 min，去上清液后再次加入5 mL 固定液固定20 min，1 200 r/min 離心7 min，去上清液，余下0.5 mL混勻制成細(xì)胞懸液，滴片，氣干，Giemsa 與瑞氏染液2∶1 比例混合，染色。

3 結(jié)果

樣本經(jīng)AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems圖像分析系統(tǒng)掃描后，分析雙核細(xì)胞數(shù)和疑似陽性雙核細(xì)胞，檢測人員根據(jù)識別標(biāo)準(zhǔn)去除假陽性雙核細(xì)胞，并在陽性雙核細(xì)胞中識別微核的數(shù)量做好記錄。樣本經(jīng)由檢測人員顯微鏡鏡下盲法閱片，只觀察雙核細(xì)胞，識別其中的陽性雙核細(xì)胞數(shù)及微核個數(shù)并做好記錄。 雙核細(xì)胞的識別標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙核細(xì)胞具有2 個獨立且核膜完整的細(xì)胞核，若細(xì)胞壞死、凋亡或細(xì)胞中為單核、3 或3 以上個多核均應(yīng)舍棄。（2）同一細(xì)胞中的雙核大小接近、色度深淺相同。 （3）如果雙核之間有1 個或多個核質(zhì)橋連接，橋?qū)挷粦?yīng)寬于其核直徑的1/4。 （4）理想的雙核邊界可以相連，但不應(yīng)該交疊，若交疊必須能識別各自的界限。（5）1 個雙核細(xì)胞胞質(zhì)與臨近細(xì)胞的胞質(zhì)之間的界限要清楚。微核的識別標(biāo)準(zhǔn)：（1）微核存在于完整的胞漿中，為圓形或橢圓形，邊緣光滑。 （2）直徑小于主核直徑的1/3。（3）微核沒有折光性。（4）微核與主核完全分開，若有相交或相切則應(yīng)該看到各自的核膜。 （5）微核的結(jié)構(gòu)與主核相同，嗜色性與主核一致或略淺[7，8]。其中以成熟的檢測人員人工盲法閱片得到的微核細(xì)胞率及微核率的數(shù)據(jù)作為近似真實值，計算誤差，允許誤差為20%。 對于得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，因細(xì)胞遺傳學(xué)中微核細(xì)胞率符合二項分布，當(dāng)n 逐漸增大時二項分布就漸漸接近于正態(tài)分布。 微核率符合泊松分布，x 逐漸增大的時，泊松分布逐漸接近于正態(tài)分布[9-11]，詳見表1。

表1 CB 微核法試驗自動識別與人工盲法閱片結(jié)果

4 討論

本試驗中，將CB 法微核試驗應(yīng)用在自動分析系統(tǒng)上，通過自動分析系統(tǒng)掃描樣片獲得圖像，復(fù)核結(jié)果快速準(zhǔn)確，解決了檢測人員用眼過度，實驗室差異以及操作人員個人識別的差異問題。 應(yīng)用AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)掃描樣片，對收獲細(xì)胞后的制片過程要求比較高，為確保制片背景的清晰，固定液選擇甲醇與乙酸，比例為3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配。制備的細(xì)胞懸液濃度不要太高，滴片時每張玻片上細(xì)胞數(shù)目不能過多，細(xì)胞間要分散良好，彼此不能重疊。 染液著色要盡可能淺，這樣掃描的圖片才有層次感，易于觀察及識別微核。 從CB法微核試驗的自動化檢測中可以發(fā)現(xiàn)，相比微核試驗的常規(guī)培養(yǎng)法及直接涂片法，對照組（即培養(yǎng)基中無添加環(huán)磷酰胺）觀察到的微核細(xì)胞率及微核率明顯高于兩者的其他實驗室正常值范圍[13]。 AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)與人工盲法閱片觀察到的微核細(xì)胞率及微核率的比較結(jié)果說明，人工盲法閱片觀察到的微核細(xì)胞率及微核率略高于AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)上最后得出的數(shù)據(jù)，分析可能存在的原因是雙核細(xì)胞中的微核與主核相疊加或相切時，AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)是無法捕捉到的。雙核細(xì)胞的判斷上也存在誤差，在觀察的過程中發(fā)現(xiàn)AXIO Imager Z2 掃描系統(tǒng)和MetaSystems 圖像分析系統(tǒng)對于出現(xiàn)核質(zhì)橋情況的判斷并不準(zhǔn)確。 本實驗室對于觀察到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢測出的各組微核細(xì)胞率符合二項分布，微核率符合泊松分布。

CB 微核法試驗因為是選擇處于第一個細(xì)胞周期的雙核細(xì)胞，所以能夠盡可能的捕捉到產(chǎn)生的微核，因而更接近損傷的真實情況，所以CB 微核法試驗的準(zhǔn)確性是優(yōu)于其他方法的微核試驗的。