高值D-二聚體檢測時(shí)稀釋倍數(shù)的探討

陳端英 蘇翠麗

(福建省福州市第七醫(yī)院 福建福州 350001)

1 前言

D-二聚體（D-Dimer，DD）是纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）之一，由纖溶酶通過降解交聯(lián)纖維蛋白生成，是一個(gè)特異性的溶纖過程標(biāo)記物。健康機(jī)體的D-D 值很低，但是若有血栓形成和繼發(fā)纖溶，D-D值就會升高，尤其是在肺栓塞和深靜脈血栓形成中，D-二聚體是唯一可反映血栓形成后的溶栓活性的物質(zhì)。 因此，一定程度上D-二聚體的定量檢測可以反映藥物的溶栓效果，可用于診斷、篩選新形成的血栓。目前，D-D 值檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肺栓塞、深靜脈血栓形成、彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）等疾病的診斷及監(jiān)測中，而且在膿毒血癥、溶栓治療、心血管疾病抗凝治療和惡性腫瘤等方面都具有非常重要的臨床參考價(jià)值[1，2]。

臨床實(shí)驗(yàn)室對于D-D 檢測的方法很多，有免疫比濁法、ELISA、NycoCard、半定量膠乳凝集法等，其中免疫比濁法應(yīng)用最廣[3]。 本研究采用的是免疫比濁法，反應(yīng)時(shí)，抗原與抗體按一定的分子比例結(jié)合，但是臨床上遇到一些異常高值標(biāo)本（即抗原過剩）[4]，可出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)（后帶現(xiàn)象），即超出了檢測的線性范圍，導(dǎo)致結(jié)果無法準(zhǔn)確測出，所以就必須將樣本稀釋后再進(jìn)行測定。 Sysmex CA1500 血凝分析儀自動稀釋檢測D-D，只能設(shè)置1 個(gè)稀釋倍數(shù)，本文對Sysmex CA1500 血凝分析儀檢測異常高值D-D 樣本時(shí)的稀釋倍數(shù)進(jìn)行了探討。

2 資料與方法

2.1 儀器與試劑

檢測儀器：全自動血凝分析儀（CA1500 型，日本Sysmex 公司）。

檢測試劑：德國SIEMENS INNOCANCE D-Dimer試劑盒，其中所含試劑為：D-Dimer 試劑（批號：561573）、D-Dimer 緩沖液（批號：561773）、D-Dimer 補(bǔ)充試劑（批號：561873）、D-Dimer 樣本稀釋液（批號：561673）、D-Dimer 校準(zhǔn)液（批號：561973）、Siemens Owren′s 巴比妥緩沖液（批號：554656）、Sysmex 原裝反應(yīng)杯（批號：L9511）、清洗液Ⅰ（批號：A9106）；Siemens 質(zhì)控品（低值批號：562242；高值批號：562142）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 校準(zhǔn)品溶解

吸取1 mL 蒸餾水對D-Dimer 校準(zhǔn)品進(jìn)行溶解，溶解后濃度為4.77 mg/L。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

在血凝分析儀上設(shè)置原校準(zhǔn)品值4.77 mg/L，對D-D 進(jìn)行定標(biāo)操作，儀器自動將校準(zhǔn)液濃縮成3/2、原液，稀釋成1/2、1/4、1/8、1/32 這6 個(gè)濃度梯度，檢測吸光度（OD 值），并自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 試驗(yàn)資料

收集40 名高值D-D 患者的枸櫞酸鈉1∶9 抗凝全血，分離出乏血小板血漿，這些樣本均排除了由于高脂、高膽紅素、高類風(fēng)濕因子、溶血等因素引起的假性D-D 增高[5]，其值均高于7.15 mg/L。

2.4 試驗(yàn)方法

對40 名高D-D 患者血漿進(jìn)行手工2、4、8、16 倍稀釋，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)為最終結(jié)果；機(jī)內(nèi)分別設(shè)置與手工稀釋相同的倍數(shù)，自動稀釋后檢測，儀器自動換算結(jié)果。 2 種方法每份樣本的各稀釋度均檢測3 次，取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理時(shí)采用SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用t 檢驗(yàn)比較機(jī)外和機(jī)內(nèi)稀釋測定結(jié)果；用單因子方差分析（ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，用LDS 多重比較法比較同一種稀釋方式不同稀釋倍數(shù)間的差異。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

溶解后的校準(zhǔn)品經(jīng)儀器自動濃縮稀釋成6 個(gè)不同濃度梯度，各稀釋度的D-D 濃度和OD 值詳見表1，儀器根據(jù)各濃度和OD 值自動繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖1。

表1 校準(zhǔn)品各稀釋倍數(shù)D-D 濃度與OD 值

圖1 D-D 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線并不是一條直線，每一濃度段的濃度（P）和OD 值（T）的相關(guān)性不同，低濃度到高濃度各段濃度P 和OD 值的相關(guān)性函數(shù)關(guān)系分別為：

3.2 異常高值D-D 樣本2 種不同稀釋方式不同稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果比較

異常高值D-D 血漿經(jīng)儀器自動稀釋和手工稀釋2 種稀釋方式稀釋后檢測，2 種稀釋方式相同稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2種稀釋方式不同稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且高倍稀釋值明顯低于低倍稀釋值，詳見表2。

表2 2 種不同稀釋方式不同稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果比較mg/L）

表2 2 種不同稀釋方式不同稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果比較mg/L）

稀釋方法手工稀釋自動稀釋P 值樣本數(shù)40 40稀釋倍數(shù) P 值2 倍 4 倍 8 倍 16 倍38.48±16.56 38.62±16.98＜0.01＜0.01＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 34.72±16.33 34.66±16.60 30.02±17.15 29.98±17.09 26.32±15.96 26.63±15.82

4 討論

D-D 不僅是血栓形成的非侵入性監(jiān)測指標(biāo)[6]，還是體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的標(biāo)志物[7]。 近年來，隨著對D-D 研究的不斷深入，關(guān)于D-D 與靜脈栓塞、感染、手術(shù)、惡性腫瘤及腦血管[8，9]等疾病的臨床應(yīng)用越來越多。溶栓是一種緊急又危險(xiǎn)的治療，D-D值可特異性地指示溶栓治療效果，D-D 的含量隨著機(jī)體纖溶過程的進(jìn)展而逐漸升高，經(jīng)治療后，若維持高值不降，則提示用藥量不足，若治療有效，則D-D含量降低，這有助于指導(dǎo)臨床用藥的調(diào)整。D-D 檢測是深靜脈血栓（DVT）篩選的有效手段，確診患者的D-D 值均升高，可用于臨床上可疑DVT 病人的篩查。惡性腫瘤一直是醫(yī)學(xué)界的難題，雖然D-D 值不是腫瘤或惡性腫瘤特異性標(biāo)志物，但是D-D 值可用于靜脈栓塞（VTE）的診斷和篩查，而VTE 是惡性腫瘤的主要并發(fā)癥，也是患者主要死亡的原因之一，所以D-D 值對其診斷及預(yù)后具有重要意義。D-D 值與心血管疾病也密切相關(guān)，其高低與疾病的種類及進(jìn)展相關(guān)聯(lián)，據(jù)報(bào)道心血管疾病患者D-D 值均有不同程度的升高，尤其是對于急性心肌梗死患者（該病患者明顯升高），且D-D 值的大小顯著受冠心病患者的危險(xiǎn)因素的影響。

臨床上檢測D-D 的方法很多，常見的有纖維蛋白原當(dāng)量（FEU）和D-Dimer（DDU）2 種，本研究的Sysmex CA1500 血凝分析儀采用的是DDU 的檢測方式并通過免疫比濁法測定。 D-D 標(biāo)本曲線的制作采用多點(diǎn)定標(biāo)方法，采用6 個(gè)濃度梯度進(jìn)行定標(biāo)，擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線并不是一條直線，每個(gè)濃度段D-D濃度值和OD 值的相關(guān)性函數(shù)關(guān)系不同，在檢測過程中，抗原抗體是按一定的比例反應(yīng)，如果D-D 濃度太高，就會出現(xiàn)后帶現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果檢測不準(zhǔn)確，甚至檢測不出來，所以必須將標(biāo)本稀釋后再進(jìn)行檢測才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。 由于儀器使用的是免疫比濁法原理進(jìn)行檢測，如果標(biāo)本存在高脂、高膽紅素、高類風(fēng)濕因子、溶血等因素，均會引起D-D 假性增高，本文所收集的標(biāo)本均排除了這些原因引起的D-D 假性增高，對超過儀器線性檢測范圍的高濃度標(biāo)本，用機(jī)內(nèi)自動稀釋和機(jī)外手工稀釋2 種不同方式分別對標(biāo)本進(jìn)行2、4、8、16 倍稀釋后進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，結(jié)果顯示，機(jī)內(nèi)外稀釋均相同倍數(shù)檢測結(jié)果之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有研究報(bào)道指出，原液與2 倍稀釋的結(jié)果差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究結(jié)果表明機(jī)內(nèi)機(jī)外2 種稀釋方式，各不同稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且稀釋倍數(shù)越高，值越小，說明隨著稀釋倍數(shù)的增加，誤差值越大，結(jié)果檢測的準(zhǔn)確性也越低，這也與先前報(bào)道相一致。Sysmex CA1500 血凝分析儀機(jī)內(nèi)只能設(shè)置1 種稀釋倍數(shù)，推薦設(shè)置8 倍稀釋，這種模式雖然方便并且節(jié)省試劑等耗材，但如果稀釋倍數(shù)太大會導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確，所以在實(shí)際工作中，必須選擇線性范圍內(nèi)能夠檢出的最小稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢測，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5 結(jié)語

綜上所述，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，在檢測高值D-D 樣本時(shí)，必須選擇線性范圍內(nèi)能夠檢出的最小稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢測，實(shí)際工作中可先考慮2 倍預(yù)稀釋進(jìn)行免疫比濁的方法檢測D-D 值，對于少數(shù)超高不能檢出的樣本可適當(dāng)增加稀釋倍數(shù)，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。 另外，本文研究的是Sysmex CA1500 血凝分析儀檢測D-D 值， 其規(guī)律是否其他機(jī)型通用有待商榷，而且由于樣本數(shù)不夠大，該方法是否更經(jīng)濟(jì)、更準(zhǔn)確、更適用于今后的臨床檢測，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。