化妝品中金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢測能力驗證實施研究

朱旭

（吉林省藥品安全監(jiān)測中心 吉林長春 130062）

1 前言

隨著人們生活水平的不斷提高，化妝品逐漸成為人們的必備用品。研究表明，運輸儲存不當(dāng)均有可能導(dǎo)致化妝品遭受細菌污染，人體使用被細菌污染的化妝品后，可能引發(fā)化膿性炎癥[1]。 積極檢測化妝品中的金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌，具有重要意義。 本次研究以吉林省藥品安全監(jiān)測中心實驗室CNAS T0710 化妝品為樣品，采用3 種菌種鑒定方法檢測化妝品中細菌種類驗證吉林省藥品安全監(jiān)測中心實驗室對化妝品中金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌檢測能力。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

BSC-1100Ⅱ生物安全柜、SPX-150 生物培養(yǎng)箱、BKQ-B100 高壓蒸汽滅菌鍋、Lepgen-96 PCR 擴增儀（山東博科公司）；全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（美國賽默飛世爾公司）；基因指紋圖譜鑒定系統(tǒng)（美國杜邦公司）。

2.2 樣品與試劑

樣品：選取CNAS T0710 化妝品作為化妝品能力驗證樣品，樣品編號為A～D。

試劑：SCDLP 液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物公司）；Baird-Parker（B-P）平板培養(yǎng)基（沈陽西隴化工有限公司）；血瓊脂平板培養(yǎng)基（青島日水生物技術(shù)有限公司）；大豆酪蛋白白瓊脂（TSA）平板培養(yǎng)基、十六烷基三甲基溴化銨平板（青島海博生物公司）；DNA 提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑（廣州吉賽生物公司）。

3 檢測方法

檢測中各個步驟均嚴(yán)格按照操作標(biāo)準(zhǔn)（樣品檢測除外），另做陽性對照1（金黃色葡萄球菌）和陽性對照2（銅綠假單胞菌）。

3.1 增菌

少量吸取SCDLP 液體培養(yǎng)基樣品置玻璃管，待玻璃管內(nèi)粉末完全溶解后，將其全部移至規(guī)格為90mL SCDLP 液體培養(yǎng)基，在36℃下培養(yǎng)24 h。

3.2 選擇性分離

于SCDLP 液體培養(yǎng)基薄膜處取培養(yǎng)物，在十六烷基三甲基溴化銨平板上行劃線接種，輕搖樣品混合液，各取1 環(huán)增菌液在B-P 平板和血瓊脂平板上行劃線接種，36℃下培養(yǎng)24 h。

3.3 生化反應(yīng)試驗

在B-P 平板上尋找特征典型菌落，取菌劃線接種于血瓊脂平板和TSA 平板，36℃下培養(yǎng)24 h 后，涂片進行革蘭染色和鏡檢，并行甘露醇發(fā)酵與血漿凝固酶試驗。 在十六烷基三甲基溴化銨平板上尋找特征典型菌落，取菌劃線接種于TSA 平板，36℃下培養(yǎng)24 h 后，涂片進行革蘭染色和鏡檢，并進行氧化酶、綠膿菌素、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、明膠液化及42℃生長試驗。

3.4 菌種鑒定

3.4.1 全自動微生物生化鑒定

于TSA 平板取單個菌落，采用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)自動鑒定菌種。

3.4.2 基因測序鑒定

參照操作要求采用DNA 提取試劑盒提取DNA，在16SrRNA 通用引物下對細菌16SrRNA 基因序列行PCR 擴增。 PCR 體系包括細菌基因組DNA2 μL，PCR 反應(yīng)混合物20 μL，正反向引物各1 μL，采用蒸餾水將體積增至40 μL。 PCR 反應(yīng)條件：于100℃下熱蓋，95℃下持續(xù)變性3 min、變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，此過程循環(huán)35 次后，72℃下延伸5 min，4℃下保存。

3.4.3 基因指紋圖譜鑒定

選取1～3 個新鮮菌落至50 μL 樣品緩沖液，充分混合，吸取30 μL 滅活，分別加入裂解液A、B 各5 μL，置于鑒定系統(tǒng)樣品孔中開始鑒定。

4 結(jié)果

生化反應(yīng)試驗結(jié)果，詳見表1、表2。3 種菌種鑒定方法檢測相似率，詳見表3。

表1 革蘭陽性生化反應(yīng)試驗結(jié)果

表2 革蘭陰性生化反應(yīng)試驗結(jié)果

表3 3 種菌種鑒定方法檢測相似率

5 討論

金黃色葡萄球菌屬革蘭陽性菌，對人體具有極強致病力，輕則引發(fā)局部化膿性炎癥，重則引發(fā)敗血癥；銅綠假單胞菌屬革蘭陰性菌，同樣對人體具有致病力，引起傷口化膿、敗血癥及其他嚴(yán)重心臟疾病[2]。我國衛(wèi)生部于2007 年頒布《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》將金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌均列入化妝品的常規(guī)檢測內(nèi)容，并嚴(yán)格要求化妝品中不得檢出以上2 種細菌，化妝品細菌檢測目前已成為各類型檢測機構(gòu)的重點工作內(nèi)容[3]。 能力驗證作為評測實驗室檢測能力的主要手段，檢測人員、檢測設(shè)備、檢測材料、檢測方法、檢測環(huán)境等因素均可對能力驗證造成影響，積極有效控制各方面因素，提高檢測人員理論儲備與操作水平，提升檢測設(shè)備性能，保證檢驗材料質(zhì)量，嚴(yán)格參照不同檢測方法的操作標(biāo)準(zhǔn)，加強檢測環(huán)境衛(wèi)生管理，才能確保獲得高質(zhì)量檢測結(jié)果[4]。 通過對參與能力驗證的實驗室進行研究分析，導(dǎo)致其檢測結(jié)果不滿意的原因可能有以下3 點：（1）檢測過程中，樣品受到污染，可能是樣品保存不當(dāng)所致或樣品相互污染所致。 （2）部分實驗室檢測手段較少，如果只通過1 種分離平板行細菌鑒定，易導(dǎo)致平板上出現(xiàn)形態(tài)不典型的菌落，進而導(dǎo)致發(fā)生菌種鑒定錯誤。 （3）操作技術(shù)不熟練也可能是導(dǎo)致菌種鑒定錯誤的常見原因，例如革蘭染色過程中需要嚴(yán)格把控各個步驟的時間，如果超出時間，則可導(dǎo)致細菌呈現(xiàn)假陰性，從而影響鑒定結(jié)果[5]。

綜上所述，吉林省藥品安全監(jiān)測中心實驗室化妝品中金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢測能力較好，積極控制檢測能力影響因素，可促進實驗室檢測能力提升。