中和稀釋法在食品微生物檢驗中的應(yīng)用探討

石文松 吳澤君 賀 晶 羅雨陽 陳陽桔 胡 群

（湖南省株洲市食品藥品檢驗所 湖南株洲 412000）

1 前言

防腐劑作為一種經(jīng)濟、方便、可有效防止食品腐敗變質(zhì)的添加劑，在食品行業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。 而防腐劑對食品微生物檢驗結(jié)果的影響也逐漸受到關(guān)注[2，3]。苯甲酸是生產(chǎn)中常見的防腐劑，探討其對微生物檢測結(jié)果的影響有助于評估樣品微生物污染的實際狀況。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

材料：某品牌果蔬飲料（標識未添加防腐劑）。卵磷脂、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鉀（AR）、鹽酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、氯化鈉（AR）（國藥集團）；苯甲酸鈉(含量99.5%）；吐溫-80（含量99.5%）；金黃色葡萄球菌（CMCC（B）26003，中國食品藥品檢定研究院）。

儀器：高壓蒸汽滅菌鍋；二級生物安全柜；恒溫培養(yǎng)箱；電子天平；電子比濁儀；冰箱。

2.2 方法

樣品制備添加苯甲酸鈉于該飲料中，使苯甲酸濃度分別為1.0、2.0、3.0、5.0 mg/mL。

稀釋液制備：配制0.9%氯化鈉溶液（稀釋液1）；磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀：1.36 g/L、磷酸氫二鈉：2.83 g/L）；含3%吐溫-80 與0.3%卵磷脂的磷酸鹽緩沖液（稀釋液2）。

菌懸液制備：將接種于平板計數(shù)瓊脂斜面上金黃葡萄球菌24 h 新鮮培養(yǎng)物（第3 代），用滅菌生理鹽水配制菌懸液，測定濁度，再稀釋至濃度約為1.5×103CFU/mL（菌懸液1）和3.7×105CFU/mL（菌懸液2）。

檢驗與數(shù)據(jù)處理各稱取1.0mL 樣品，分別加入9.0 mL 稀釋液，混勻，作用5 min，再加入1 mL 菌懸液1，混勻，作為樣品組1。 取樣品各25 mL，分別加入1 mL 菌懸液2，混勻，室溫條件下作用30 min，分別加入225 mL 的稀釋液，混勻，作用5 min，作為樣品組2。 取各樣品組檢測樣溶液1.0 mL 檢驗菌落總數(shù)。 以等體積稀釋液替代檢測樣依法加入菌懸液作為陽性對照，以各稀釋液為空白對照，每組重復試驗4 次，觀察結(jié)果分析各組數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果

3.1 樣品組1 檢測結(jié)果

樣品組1 檢測結(jié)果（各次試驗菌落數(shù)均值）詳見表1。

除苯甲酸濃度為3.0 mg/mL 和5.0 mg/mL 且以稀釋劑1 處理的檢測樣外，其余檢測樣菌落數(shù)回收率均在90%～110%，誤差率＜15.0%。

3.2 樣品組2 檢測結(jié)果

樣品組2 檢測結(jié)果，詳見表2。

苯甲酸濃度為0、1、2 mg/mL，各檢測樣菌落數(shù)差異沒有統(tǒng)計學意義；苯甲酸濃度為3、5 mg/mL 時，稀釋劑1、稀釋劑2 處理的樣品菌落數(shù)差異有統(tǒng)計學意義，但稀釋劑2 的檢測結(jié)果相對接近苯甲酸濃度為0 mg/mL 的結(jié)果。

表1 樣品組1 檢測結(jié)果

表2 樣品組2 檢測結(jié)果

4 討論

近年來，防腐劑的新品種不斷被研究開發(fā)[4，5]，藥品、化妝品等產(chǎn)品檢驗標準均規(guī)定了防腐劑對微生物項目檢驗結(jié)果影響的相應(yīng)評估或消除、減弱的措施或方法[6]，食品也引起部分研究者的關(guān)注，并對其影響進行探索和評價[7]。 苯甲酸作為常見防腐劑，主要通過非選擇性的抑制細胞呼吸酶系的活性（阻礙乙酰胺輔酶A 的縮合反應(yīng)）以及改變細胞膜的通透性，干擾微生物的生長代謝[8]，其對微生物檢驗結(jié)果的影響需進一步探索。

研究中發(fā)現(xiàn)，以模擬樣品為基質(zhì)設(shè)計樣品組，比較2 種稀釋劑對苯甲酸的稀釋中和作用，樣品組1在其濃度≥3.0 mg/L 時，生理鹽水的影響較弱，菌落回收率較低及組間誤差率較大；以含吐溫-80、卵磷脂及具緩沖作用稀釋劑處理的菌落回收率較好，組間誤差率較小。 組間誤差率大于15%，則表示中和劑未達到很好的中和作用[9]，苯甲酸的抑菌作用并沒有得到較好的控制。樣品組2 的試驗進一步說明，在其濃度為3.0 mg/L 和5.0 mg/L 時，不同稀釋液處理樣品的檢測結(jié)果存在差別，稀釋劑2 處理樣品的檢測結(jié)果更接近于微生物實際污染狀況。 在稀釋劑中添加吐溫-80、卵磷脂，兩者均為表面活性劑，可消除菌體和防腐劑的結(jié)合或在菌體形成保護膜，減少菌體損害。此外，防腐劑與殺菌劑在一定條件下可相互轉(zhuǎn)化。 pH 越低苯甲酸殺菌效果越好，在酸性條件下，0.1%的含量也具有強效殺菌作用[10]。而具有較好緩沖能力的稀釋劑可改變樣品處理液的pH，使苯甲酸的抑菌能力減弱，間接減少其對微生物的生長抑制或損害。因此，對添加防腐劑的樣品使用具有中和作用的稀釋劑，可使檢驗結(jié)果更接近微生物污染的真實值。 尤其在不明確樣品pH 或苯甲酸濃度的情況下，有利于減弱或降低微生物的生長抑制或損害，以及后續(xù)培養(yǎng)中菌體的自我修復與生長。