高效液相色譜法測(cè)定禽蛋中膽固醇的含量

劉阿靜 虎惠媛 彭嬿雯 張紅艷 王慧珺 王 波 伏慶紅

（1.蘭州海關(guān)技術(shù)中心 甘肅蘭州 730010；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；3.甘肅泛植制藥有限公司）

1 前言

膽固醇是人體內(nèi)不可或缺的一種重要物質(zhì)，主要參與細(xì)胞膜、多種激素、膽汁酸及維生素D 的合成，其含量直接影響人體的健康狀況，過高會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化并誘發(fā)一些綜合并發(fā)癥，過低易導(dǎo)致血管壁脆性增加，導(dǎo)致人體免疫力和應(yīng)急能力降低[1-4]。 因此，控制飲食中攝入的膽固醇量尤為重要，通常人體攝入膽固醇的來源主要為禽蛋類和肉類，而膽固醇是影響禽蛋品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道禽蛋中膽固醇的測(cè)定方法主要有試劑盒法、比色法、高效液相色譜法（HPLC）等[5-8]。試劑盒法和比色法操作步驟煩瑣，試驗(yàn)干擾較大，結(jié)果準(zhǔn)確性不高，而HPLC 分離效能強(qiáng)，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，相關(guān)報(bào)道的文章不多。 筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)試驗(yàn)皂化方法，研究出了針對(duì)禽蛋中膽固醇含量分析的測(cè)定技術(shù)，可以準(zhǔn)確定量禽蛋中的膽固醇，為保障人體健康提供一定的技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

儀器：Waters 2695 高效液相色譜儀，配置紫外檢測(cè)器（美國Waters 公司）；電子天平（±0.1 mg，德國Sartorius 公司）；均質(zhì)機(jī)（VCX750，美國SONICS 公司）。

試劑：膽固醇（200 μg/mL，色譜純，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司）；氫氧化鉀；無水硫酸鈉；無水乙醇；石油醚（沸程30℃～60℃）；無水乙醚（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；蒸餾水；禽蛋樣品。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱：SVER-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇；檢測(cè)波長：205 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確移取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液5、2.5、1.25、0.25、0.125、0.050、0.025 mL 于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為200、100、50、10、5、2、1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度工作液，置于4℃條件下冷藏待用。

2.2.3 樣品處理

參考GB 5009.128—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膽固醇的測(cè)定》[9]中第二法略作修改。 取每種禽蛋5 枚去皮，勻漿機(jī)攪拌均勻。稱取制備后的全蛋樣品1.0 g（精確至0.001 g）于250 mL 圓底燒瓶（加入適量沸石）中，隨后參照GB 5009.128—2016 中方法進(jìn)行皂化，皂化結(jié)束后，室溫冷卻30 min 后提取。提取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水轉(zhuǎn)移到玻璃離心管中，提取液氮吹至近干，最終用甲醇溶解并定容至50 mL，過0.45 μm 有機(jī)濾膜，待測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)選擇3 款固定相差異明顯的色譜柱進(jìn)行篩選，分別為色譜柱SVER-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、CR1:4（150mm×4.6mm，5μm）和MGII（150mm×4.6mm，5 μm），結(jié)果見圖1～圖3。色譜柱SVER-C18 和CR1:4對(duì)膽固醇的分離能力均較好，峰型尖銳，整個(gè)試驗(yàn)分離過程基線平穩(wěn)，能實(shí)現(xiàn)快速有效的分離，而CR1:4色譜柱中膽固醇出峰時(shí)間相對(duì)較晚；色譜柱MGII雖然能對(duì)膽固醇進(jìn)行分離，但是峰型較寬，不利于目標(biāo)物的定性和定量。 從檢測(cè)成本及普適性方面綜合考慮，試驗(yàn)最終選取SVER-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離測(cè)定禽蛋中膽固醇。

3.2 樣品皂化冷卻后放置時(shí)間的優(yōu)化

本試驗(yàn)分別對(duì)樣品經(jīng)加熱皂化后冷卻至室溫提取的放置時(shí)長10、20、30、40、50、60 min 進(jìn)行了考察。通過回收率試驗(yàn)可知，膽固醇含量隨著放置時(shí)長的增加而增大，當(dāng)放置時(shí)長為30 min 時(shí)，膽固醇含量達(dá)到最大值，隨著放置時(shí)長的延長，膽固醇含量幾乎保持不變。因此，皂化冷卻后的樣品溶液應(yīng)至少放置30 min 后提取效果更佳。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在優(yōu)化的最佳色譜條件下，取配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)行測(cè)定分析， 以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)系列峰面積對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度進(jìn)行線性擬合，回歸方程為Y=6.27×103X-7.11×103，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。 結(jié)果表明，方法在1～200 mg/L 內(nèi)線性關(guān)系良好，該方法的檢出限（S/N=3）為0.5 mg/L，定量限（S/N=10）為1.67 mg/L。

圖1 SVER-C18 色譜柱對(duì)禽蛋中膽固醇分離效果的影響

圖2 CR1:4 色譜柱對(duì)禽蛋中膽固醇分離效果的影響

圖3 MGII 色譜柱對(duì)禽蛋中膽固醇分離效果的影響

3.3.2 精密度和加標(biāo)回收率

在樣品1#（膽固醇含量為272.29 mg/100 g）中分別添加高、中、低3 個(gè)不同濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分渦旋混合均勻，按照“2.2.3”進(jìn)行樣品處理，“2.2.1”分析測(cè)試，重復(fù)測(cè)定6 次。 具體分析結(jié)果詳見表1。由表1 可知，不同濃度添加水平下，平均加標(biāo)回收率在91.04%～96.88%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.21%～1.90%，表明HPLC 測(cè)定禽蛋中膽固醇的分析方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性和精密度良好。

3.4 實(shí)際樣品測(cè)定

根據(jù)試驗(yàn)優(yōu)化的最佳條件以“2.2.3”進(jìn)行樣品處理，按照“2.2.1”色譜條件分別對(duì)多種不同類禽蛋進(jìn)行分析測(cè)試，并與膽固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間對(duì)照定性，采用外標(biāo)法定量，樣品色譜圖詳見圖4，具體結(jié)果詳見表2。 結(jié)果顯示，在優(yōu)化的最佳試驗(yàn)條件下，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均能得到很好的分離，表明該方法適用于不同禽蛋中膽固醇的測(cè)定。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

圖4 樣品中膽固醇色譜圖

表2 不同禽蛋樣品中膽固醇含量測(cè)定

4 結(jié)論

本文通過對(duì)色譜條件、樣品皂化后冷卻時(shí)長、方法學(xué)的考察和優(yōu)化，建立了高效液相色譜分析檢測(cè)不同類禽蛋中膽固醇含量的測(cè)試方法，該方法操作簡便、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度高，回收率符合試驗(yàn)要求，為實(shí)際檢測(cè)禽蛋樣品中膽固醇提供了規(guī)范、有效的技術(shù)支持，也為其他樣品中膽固醇的檢測(cè)奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。