海蛇科毒素生化性質(zhì)及作用機理研究進展

王湘君,王雅楠,陳 文,羅 蒙,林杰曼

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 a.水產(chǎn)與生命學(xué)院 b.兩棲爬行動物研究省級重點實驗室;c.海洋科學(xué)技術(shù)學(xué)院,海南 三亞 572022;2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,南京 201146)

0 前言

海蛇科(Hydrophiidae)隸屬于爬行綱(Reptilia),有鱗目(Squamata)、蛇亞目(Serpentes).其主要特征為:鼻孔背位,無鼻間鱗,腹鱗較小,甚或退化消失,卵胎生或胎生,產(chǎn)仔.我國已知3種扁尾海蛇:藍灰扁尾海蛇(Laticaudacolubrina)、扁尾海蛇(L.laticaudata)、半環(huán)扁尾海蛇(L.semifasciat).扁尾海蛇屬在某種程度上屬兩棲海蛇,定期離開水.交配時會回歸到陸地,雄性會以抽動身體的姿態(tài)來向雌性示愛.卵生.雌性把卵產(chǎn)在陸地.棲息于淺海和珊瑚礁.主要食物為魚.還有棘鱗海蛇(AstrotiaAcalyptophis)、棘眥海蛇(Acalyptophisperonii)、青環(huán)海蛇(Hydrophiscyanocinctus)、青灰海蛇(H.caerulescens)平頦海蛇(Lapemiscurtus)海蛇亞科有14個屬約55種,分布于非洲東岸沿海到熱帶美洲西岸沿海,長吻海蛇分布貫穿此廣大海域,其余種類均限于此范圍內(nèi)沿岸淺海,一些種類特化只適于攝食1～2種類型的魚類或只吃魚卵,頭體長一般0.5～1 m,棘鱗海蛇全長可達1.6 m.我國已知有8屬13種.

1 常見海蛇的毒素成分

趙延德[1]研究發(fā)現(xiàn)海蛇蛇毒與眼鏡蛇毒相似,主要毒性成分是突觸后神經(jīng)毒素.鐘肖芬等[2]發(fā)現(xiàn)海蛇毒素為神經(jīng)毒素和細胞毒素,海蛇毒素中以神經(jīng)毒素為主.神經(jīng)毒素分為突觸前神經(jīng)毒素和突觸后神經(jīng)毒素,根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列和功能的不同,突觸后神經(jīng)毒素分短鏈神經(jīng)毒素和長鏈神經(jīng)毒素.

Kim H S等[3]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒性蛋白是以一種結(jié)晶形式從扁尾海蛇、藍灰扁尾海蛇的毒液中分離而來.兩種的毒素氨基酸組成和其他性質(zhì)相似,從而得出結(jié)論,這兩個物種分泌相同的毒素,該毒素被命名為扁尾蛇毒素A.

吳方輝等[4]研究發(fā)現(xiàn)半環(huán)扁尾海蛇毒液主要成分是神經(jīng)毒素,短鏈神經(jīng)毒素(ETX)存于該蛇中.曾家榮等[5]實驗證明平頦海蛇蛇毒初步測定為突觸后神經(jīng)毒素.陳家樹等[6]實驗得到平頦海蛇毒同時有肌肉毒和神經(jīng)毒,神經(jīng)毒是平頦海蛇的主要毒素成分.梁京生等[7]分離純化平頦海蛇神經(jīng)毒組分Ⅷ-2-4,發(fā)現(xiàn)組分Ⅷ-2-4很可能是屬突觸后長鏈神經(jīng)毒素.王博[8]通過將平頦海蛇和青環(huán)海蛇的毒素比對得出二者蛋白組成相似,主要為神經(jīng)毒素.

2 毒素理化結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

2.1結(jié)構(gòu)

2.1.1 半環(huán)扁尾海蛇

半環(huán)扁尾海蛇毒素c由62個氨基酸殘基組成,比半環(huán)扁尾海蛇b少了Asp(或Asn).Nobuo Tamiya等[9]得出結(jié)論半環(huán)扁尾海蛇毒素c是[51-天冬酰胺]-半環(huán)扁尾海蛇b.Endo T等[10]研究表明存在于半環(huán)扁尾海蛇中的ETX共有62個氨基酸殘基,4對二硫鍵,呈三指型半環(huán)狀空間結(jié)構(gòu).

2.1.2棘鱗海蛇

Maeda N等[11]測得棘鱗海蛇毒素的氨基酸序列為:Met-Thr-CmCys-CmCys-Asn-Gln-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Lys-Thr,分子量為6 600.毒素B和C分別是由70和72個氨基酸殘基與十個半胱氨酸殘基組成.

Endo T等[12]研究表明棘鱗海蛇B和C毒素的分子構(gòu)象是長軸phe-25神經(jīng)毒素.維持穩(wěn)定靠Ile/val-42,Ala-46和Ile-58疏水鍵相互作用,而不是其他神經(jīng)毒素Tyr-25和Glu-42之間的氫鍵.

2.1.3藍灰扁尾海蛇

Hyung S K等[13]藍灰扁尾海蛇毒素Lca、Lcb分子中含有69個氨基酸殘基8個半胱氨酸殘基.毒素Lca和Lcb在序列31,32,33,50和53位氨基酸不同.毒素Lca與Lcb含4個二硫鍵,整個氨基酸序列是同源長鏈神經(jīng)毒素,毒素Lca和Lcb檢測誤差為6%.

2.1.4棘眥海蛇

Endo T等[14]對毒素測定得棘眥海蛇的氨基酸序列為:Trp-Tyr-Met-Val-Asp-Leu-Ala.Mori N等[15]表明棘眥海蛇毒素分子結(jié)構(gòu)由60個氨基酸殘基的氨基端和Met、Asn的羧基末端組成,含有九個半胱氨酸殘基.

2.1.5平頦海蛇

Servent D等[16]和Tamiya T等[17]指出平頦海蛇中短鏈神經(jīng)毒素含60～62個氨基酸殘基,4對二硫鍵.長鏈神經(jīng)毒素由66～79個氨基酸殘基5對二硫鍵構(gòu)成.短鏈神經(jīng)毒素具有一個共同的三指環(huán)結(jié)構(gòu),環(huán)I含4～16位氨基酸殘基,環(huán)II有25～40位氨基酸殘基,環(huán)III為44～53位氨基酸殘基.鐘肖芳等[2]發(fā)現(xiàn)平頦海蛇短鏈神經(jīng)毒素SN12、SN36和SN160之間只存在第46位氨基酸殘基的差異,但生物活性上有明顯區(qū)別.

2.1.6青環(huán)海蛇

Li P S等[18]在青環(huán)扁尾海蛇毒素中發(fā)現(xiàn)三個不同基因,命名sn311、sn316、sn285三個基因編碼不同的短鏈α-神經(jīng)毒素,含有21個氨基酸的信號肽和60個氨基酸的成熟肽.基因sn311和sn316編碼的成熟肽同源性高,唯一差別是Lys46和Ser46不同.而sn285編碼的成熟肽缺乏穩(wěn)定氨基酸,如Asp31和Arg33.

2.2性質(zhì)

李其斌等[19]認為,海蛇毒毒性較穩(wěn)定,經(jīng)100 ℃,5 min處理后仍能保持毒性,在酸、堿環(huán)境下也同樣穩(wěn)定.

2.2.1半環(huán)扁尾海蛇

Nobuo T等[20]估計半環(huán)扁尾海蛇毒素的相對分子量為7 000.

Nobuo UI等[21]研究表明半環(huán)扁尾海蛇毒素a和b顯示相同等電點為PH 9.68.對于[1-N-乙酰精氨酸],[15-N6-乙?；嚢彼猁}],[27-N6-乙?；?賴氨酸],[47-N6-丙?；?賴氨酸]和[51- N6-乙?；?賴氨酸鹽]在半環(huán)扁尾海蛇毒素b的pH值分別9.52,9.31,9.45,9.22和9.09,半環(huán)扁尾海蛇毒素c的等電點和[51-天冬酰胺]-半環(huán)扁尾海蛇毒素b、[51-N6-乙?；?賴氨酸]-半環(huán)扁尾海蛇毒素b是相同的.

2.2.2棘鱗海蛇

Maeda N.等[11]572研究表明棘鱗海蛇毒液包括酰胺化的C-末端的長鏈神經(jīng)毒素蛋白.

2.2.3青環(huán)海蛇

蘇拔賢等[22]研究表明,蛇毒是由蛇的毒腺分泌的含有多種毒素、蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì).Li PS等[18]青環(huán)海蛇蛇毒提純后,得到約10 mg·L-1的重組蛋白,其純度可達95%.

萬德源等[23]用考馬斯亮法測得青環(huán)海蛇毒素蛋白質(zhì)含量為97%,為低分子量蛋白組.Mackessy等[24]指出在青環(huán)海蛇的毒液較小的毒素占主導(dǎo),特別是3Ftxs和PLA2.Juan J.Calvete等[25]研究表明青環(huán)海蛇毒液中發(fā)現(xiàn)17個蛋白( 5個type-I PLA 2分子 和12個3Ftxs分子).毒液中3Ftxs占81%,type-I PLA 2占19%.青環(huán)海蛇毒液蛋白質(zhì)組只有6種毒液組分3種短鏈神經(jīng)毒素,2種長鏈神經(jīng)毒素,一分子PLA 2.

Saeedeh M K等[26]研究表明青環(huán)海蛇的毒液中短鏈神經(jīng)毒素,長鏈神經(jīng)毒素和堿性磷脂酶A2,其分子量估計分別為7 285 Da,10 838 Da,和14 235 Da.

2.2.4平頦海蛇

吳祥褆等[27]在早年研究中發(fā)現(xiàn)平頦海蛇毒中所含的乳酸脫氫酶量較多,推測這可能是海蛇科毒蛇原蛇毒中LDH遠較其他蛇科強的原因之一.

卓肇文等[28-29]證明平頦海蛇中胰蛋白酶能催化水解堿性氨基酸的羧基所組成的肽鍵和酯鍵,并發(fā)現(xiàn)蛇毒中的蛋白酶抑制劑的功能可能是對蛇毒中的其他活性蛋白質(zhì)與多肽起保護作用.

1990年我國廣州中山醫(yī)科大學(xué)藥理教研室實驗發(fā)現(xiàn)平頦海蛇肌肉毒素約占粗毒總蛋白量的32.2%;神經(jīng)毒約占粗毒蛋白質(zhì)總量的52.3%[30].

吳世海等[31]從北部灣平頦海蛇粗毒分離出7種毒素,分別命名為平頦海蛇毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ.進一步通過實驗分析表明平頦海蛇毒素Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ為短鏈毒素,而毒素Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ為中鏈毒素.

周琦等[32]通過多種研究方法對廣西沿海平頦海蛇和青環(huán)海蛇進行分析,表明兩種海蛇的總氮量、蛋白質(zhì)、氮基酸、脂肪酸、灰分、重金屬和微量元素的組成和含量相近.

2.3磷脂酶A2

蘇拔賢等[33]研究表明平頦海蛇中磷脂酶A-2對鈣、鈉、鎂、鋅、銅具有抑制作用.

Arni R K等[34]發(fā)現(xiàn)蛇毒PLA-2除了酶活性外,還具有多種生理活性,如神經(jīng)毒、心臟毒、肌毒、細胞毒、溶血作用、抗凝集作用等.這些活性或者與酶活性相關(guān),或者完全獨立于酶活性之外.

楊文利等[35]專門研究了平頦海蛇毒磷脂酶A-2基因多樣性.平頦海蛇毒腺中至少含有3種不同PLA-2,大致可分為酸性和弱堿性.推算三者等電點,發(fā)現(xiàn)這3種PLA-2均屬于Ⅰ類磷脂酶A-2家族.其中PLA2-8與澳大利亞虎蛇(Notechisscutatusscutatus)的PLA2有81%同源;而PLA2-9和PLA2-384則鉤鼻海蛇(Enhydrinaschistosa)的肌毒PLA290%同源.之后又發(fā)現(xiàn)PLA2-9具有與天然PLA2相近的酶活性;并具有對HL60等幾種腫瘤細胞的細胞毒作用[36].

歐陽平等[37]研究表明重組平頦海蛇磷脂酶A-2具有明顯的抑制基礎(chǔ)生長狀態(tài)下的大鼠血管平滑肌細胞增殖的作用.試驗表明rPLA2能明顯抑制由晚期糖基化終產(chǎn)物刺激的大鼠血管平滑肌(VSMCs)增殖[38].研究表明，利用基因工程技術(shù)獲得的rPLA-2在一定劑量下對成纖維細胞增殖有明顯的抑制作用[39].

王博等[8]65指出，平頦海蛇和青環(huán)海蛇毒素蛋白組成相似,均以神經(jīng)毒素和磷脂酶A2為主.

3作用機理

海蛇毒致死主要是其毒液中分離出來的α-神經(jīng)毒素的毒性作用,它競爭結(jié)合于骨骼肌突觸后膜上的煙堿型乙酰膽堿受體,阻斷乙酰膽堿與受體結(jié)合,導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭傳遞阻斷,阻斷膽堿能神經(jīng)肌肉接頭,引起麻痹.毒素作用于乙酰膽堿受體,使興奮一直保持,即麻痹作用一直存在,導(dǎo)致肌肉無力、酸痛、眼瞼下垂,嚴重則導(dǎo)致心臟和腎臟損傷,最終死亡.另外肌肉毒素作用于橫紋肌,使橫紋肌細胞損害釋出鉀離子、肌紅蛋白,高血鉀可引起心臟抑制,肌紅蛋白堵塞腎小管引起急性腎功能衰竭.除了突觸后神經(jīng)毒素能引起神經(jīng)肌肉阻斷外,所含的磷脂酶A2也有肌肉毒性,對腎、肝、肺有一定的破壞作用[40-41].

Karthikeyan R等[42]實驗表明平頦海蛇的毒性較強,在小鼠的腹腔試驗中,平頦海蛇的毒液可以引起壞死、水腫和細胞浸潤,出現(xiàn)空腔化等現(xiàn)象.

4 總結(jié)

本文通過閱讀國內(nèi)外有海蛇蛇毒文獻和期刊得出,和大多數(shù)毒蛇一樣海蛇蛇毒大部分以神經(jīng)毒為主,不同海蛇毒素中成分有不同,有相似的部分.海蛇咬傷由于海蛇毒牙較小,并垂直刺入的特點,相較于其他咬傷不易察覺.毒力也在毒蛇中較強.近幾年來,對于扁尾海蛇屬的研究越來越深入,研究的文獻較多,涵蓋領(lǐng)域包括神經(jīng)毒素、生物合成、理化性質(zhì)、分子序列結(jié)構(gòu)、作用機理等方面.尤其是對半環(huán)扁尾海蛇和平頦海蛇的神經(jīng)毒素的研究較廣,是國內(nèi)外研究者的研究熱門課題之一.而對于其他海蛇,在國內(nèi)只研究其微量元素,在國外的文獻中,也很少相關(guān)的具體描述資料.海蛇血清的應(yīng)用率較其他毒蛇類應(yīng)用率較低,研究其結(jié)構(gòu)、作用機理有利于海蛇毒素的藥用價值及經(jīng)濟價值,這有待相關(guān)學(xué)者進一步的開發(fā)研究.