食品中沙門氏菌檢測方法研究進展

覃湘婕，孫寧與，李春堯，楊 榮，吳永寶*

（1.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅 蘭州 730010）

1885年，在霍亂流行時分離到豬霍亂沙門氏菌，定名為沙門氏菌屬（Salmonellasp.）。沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，種類繁多，目前已檢測出2 500多種沙門氏菌血清型[2]。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性的腸道桿菌，不但能顯性或隱性感染動物，而且能通過污染的動物源性食品造成人的食物中毒，嚴重危害公共健康安全。根據(jù)歐洲食品安全局（European Food Safety Agency，EFSA）統(tǒng)計，歐洲每年有超過10萬例的人類沙門氏菌病[3]。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）統(tǒng)計顯示，在美國每年的沙門氏菌感染已經(jīng)增加到1 200萬人，引起大約1.9萬人住院甚至450人死亡[3]。我國內(nèi)陸地區(qū)由沙門氏菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的首位。目前沙門氏菌的檢測方法主要包括傳統(tǒng)生理生化檢測方法、免疫學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)方法以及近年來多學(xué)科聯(lián)合應(yīng)用的新型檢測方法，如生物傳感器技術(shù)、納米技術(shù)、基于適配體檢測技術(shù)等，這些方法為進行沙門氏菌的準確、快速、靈敏的檢測提供了方向。本文對沙門氏菌的檢測方法研究進展進行了概述，為沙門氏菌病的檢測和防控提供參考。

1 傳統(tǒng)生理生化檢測方法

傳統(tǒng)生理生化方法的檢測過程包括樣品預(yù)增菌、增菌、分離培養(yǎng)、生化試驗和血清學(xué)鑒定，具有較高的準確性，是國際和國內(nèi)食品中沙門氏菌檢測的標準方法[4]。國際標準ISO 6579《食品和動物飼料的微生物學(xué)—沙門氏菌檢測的基準方法》[5]、GB4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》[6]分別是目前用于食品中沙門氏菌檢測方法，但是在沙門氏菌病的應(yīng)急處理中經(jīng)常需要盡快得到檢測結(jié)果，傳統(tǒng)生理生化方法的檢測周期約4～7 d，操作繁瑣，更多依靠于主觀判定，并且腸桿菌科的生化鑒定具有交叉性，在檢測速度、特異性、敏感性等方面有一定的局限性。

顯色培養(yǎng)基法和添加物質(zhì)法均可以加快病原菌的分離和鑒定，其中利用顯色培養(yǎng)基法進行檢測后結(jié)果準確，并易于判定，該方法已經(jīng)被收錄于GB/T 4789.4—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》及以后版本的標準中[7]，但是具有較高的實驗成本；添加物質(zhì)法可以縮短檢測時間至2 d[8]。疏水網(wǎng)膜法可以提高病原菌的富集效率，該方法操作更為簡便，檢測時間縮短至3 d[9]。以上改進方法明顯縮短了沙門氏菌的檢測時間，降低了檢測限，但是無法徹底解決傳統(tǒng)方法檢測周期長、操作繁瑣的問題。因此需要研究準確、方便的沙門氏菌快速檢測方法。

2 免疫學(xué)檢測方法

免疫學(xué)技術(shù)是以免疫學(xué)為理論基礎(chǔ)利用抗原抗體的特異性反應(yīng)對細菌進行放大檢測的一種方法，具有靈敏性較高、檢測時間短、高通量的優(yōu)點，因此在食品微生物檢測中得到普遍應(yīng)用。

2.1 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）最早是于1977年首次應(yīng)用以檢測食品中沙門氏菌，目前已經(jīng)成為沙門氏菌檢測中的常用免疫分析技術(shù)，它是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶的催化作用相結(jié)合來檢測特異性抗原[10]。ELISA主要包括直接ELISA、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA及競爭ELISA等[7]。ELISA法的檢測效率高于傳統(tǒng)檢測法，但也需要長時間增菌，操作中會出現(xiàn)假陽性和假陰性，并且ELISA難以檢測多種病原。該技術(shù)目前需要研究具有高特異性的重組抗原，并能進行多種標記的全自動酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。伍燕華等[11]用抗沙門氏菌多克隆抗體和抗沙門氏菌單克隆抗體C1359建立了沙門氏菌的雙抗夾心ELISA檢測方法，可以快速檢測A、B、C、D、E等五種典型沙門氏菌，最低可以檢測的沙門氏菌純培養(yǎng)液濃度為1×104CFU/mL。WILANEE C等[12]將具有大表面積和良好生物相容性的SWCNT作為鼠傷寒沙門氏菌抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的載體，建立成一個Ab/SWCNTs/HRP結(jié)構(gòu)的信號放大探針，以此探針對鼠傷寒沙門氏菌進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度是傳統(tǒng)ELISA法的1 000倍。方一臻[13]將外膜蛋白PagC進行重組純化，經(jīng)過各條件優(yōu)化建立了檢測沙門氏菌抗原的間接ELISA方法，該方法重復(fù)性好、特異性強、可以應(yīng)用于沙門氏菌的主要血清型中。何一欣[14]經(jīng)過篩選得到了腸炎沙門氏菌的納米抗體，并建立了檢測牛奶樣品中腸炎沙門氏菌的雙抗體夾心ELISA方法，靈敏度為1～10 CFU/mL，為快速檢測沙門氏菌提供了技術(shù)支持。

2.2 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique，IFT）的基本原理是將熒光色素標記在抗體（抗原）上，與對應(yīng)的抗原（抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下發(fā)出可見熒光，從而定性檢測抗原（抗體）。熒光物種類一般有異硫氰酸熒光素、羅丹明熒光素、二氯三嗪基氨基熒光素等。該檢測方法操作簡便，結(jié)果直觀，特異性好，但缺點是會產(chǎn)生非特異性染色[8]，敏感性較低[7]。WANG B B等[15]建立了一種檢測蛋殼上沙門氏菌的高特異性免疫熒光法，該方法將熒光強度高、水溶性好的CdTe量子點作為標記物與沙門氏菌抗體結(jié)合，量子點標記抗體與沙門氏菌發(fā)生特異性反應(yīng)，最低檢出限為1×102CFU/mL。PANDEY S K等[16]建立了一個檢測傷寒沙門氏菌的新型夾心熒光免疫分析方法，以抗Vi莢膜多糖抗體為捕獲劑，以陽離子受體分子多黏菌素B為粘結(jié)劑，檢出限為10 CFU/mL。夏圣等[17]以納米熒光碳點（carbon dots，CDs）這一新型納米材料作為免疫示蹤材料來檢測樣品中乙型副傷寒沙門氏菌。該方法將抗沙門氏菌Ha因子抗體與CDs耦聯(lián)制備出免疫納米熒光碳點，并將抗沙門氏菌O4因子抗體與磁珠粒耦聯(lián)進行樣品中乙型副傷寒沙門氏菌的富集后，再與免疫熒光碳點產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，形成抗O4-磁珠-細菌-抗Ha-CD免疫復(fù)合物。使用免疫親和分離液從復(fù)合物中除去磁珠粒，通過檢測分離液中CDs的熒光強度來推算樣品中病原菌的量。此方法的檢測下限為103CFU/mL，檢測時間約2 h。

2.3 免疫磁性分離技術(shù)

由于食品樣品經(jīng)常為固液多相混合態(tài)，采用傳統(tǒng)方法難以分離出少量致病菌。免疫磁性分離技術(shù)（immunomagnetic separation technique，IST）是將磁性顆粒與抗體特異性偶聯(lián)，偶合物與樣品中致病微生物進行特異性結(jié)合，結(jié)合了致病微生物的磁珠在磁場的作用下向磁極方向移動，與樣品處理液分開，得到濃集的致病菌。此技術(shù)提高了病原的濃縮效率，經(jīng)常與免疫學(xué)、生物學(xué)等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，具有更高的靈敏度和特異性，并且不需要前增菌步驟，檢測時間縮短至僅為幾小時[18]。申靜等[19]將結(jié)合了沙門氏菌單抗的羧基磁珠作為免疫磁珠，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）納米探針，建立一種快速方法來進行樣品中沙門氏菌的特異性檢測。李亞茹等[20]用納米磁珠結(jié)合抗沙門氏菌多克隆抗體，經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化建立了免疫磁珠分離方法。并根據(jù)沙門氏菌ttr基因合成引物和探針，建立實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）方法。將這兩種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，實現(xiàn)了高效、靈敏地檢測蝦中沙門氏菌。免疫磁性技術(shù)具有選擇性分離、快速濃縮的優(yōu)點，是綜合磁載體技術(shù)和免疫學(xué)的一項重要檢測技術(shù)。

2.4 免疫層析法

免疫層析法（immunochromatography assay，ICA）的原理是將抗體固定在硝酸纖維素膜的某區(qū)域，再將樣品浸入干燥的硝酸纖維素膜一端，樣品在毛細管的作用下沿該膜移動，當?shù)竭_有抗體的區(qū)域時，樣品中的抗原會特異性地結(jié)合抗體，采用酶染色或膠體金使發(fā)生免疫反應(yīng)的區(qū)域顯色，來進行病原體的特異性檢測。該技術(shù)以免疫滲透為基礎(chǔ)，具有簡單快速、成本低廉、穩(wěn)定性好的優(yōu)點[7]，但也存在靈敏度較低、無法定量的問題。劉志科等[21]建立了一種雞白痢沙門氏菌抗體檢測的膠體金免疫層析法，該方法將invA基因進行原核表達并純化，將山羊抗體IgY用30 nm膠體金溶液標記，分別包被于NC膜上作為檢測線和質(zhì)控線。該方法準確度高、方便快速。李倩茹等[22]建立了以熒光微球為標記物的熒光微球免疫層析檢測法，將抗體與羧基化的磁性微球偶聯(lián)，再將熒光微球免疫層析法與抗鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠相結(jié)合以濃縮和檢測食品中的鼠傷寒沙門氏菌。該法具有快速、特異、靈敏的優(yōu)點。

2.5 免疫組織化學(xué)法

免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）也稱為免疫細胞化學(xué)法，是指特異性抗體經(jīng)過顯色劑標記后與組織細胞內(nèi)抗原進行特異性結(jié)合并產(chǎn)生呈色反應(yīng)，以對組織細胞內(nèi)抗原進行定位、定性、定量檢測的一種方法。此方法通過利用熒光顯微鏡、電子顯微鏡對細胞、亞細胞水平的抗原物質(zhì)（病原體、多肽、蛋白質(zhì)、激素、酶等）進行顯像和放大來檢測各種抗原，具有敏感性高、特異性強、適用廣泛的優(yōu)點。免疫組織化學(xué)技術(shù)主要包括免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)。黃策等[23]利用紅細胞吸附免疫熒光技術(shù)解決了熒光免疫快速檢測沙門氏菌中雜菌的干擾，但是該技術(shù)中的紅細胞使用前必須先用抗體致敏，并且紅細胞上由于抗體少，針對病原菌含量少的樣品可能會出現(xiàn)假陰性。他們后來建立了玻片固相抗體吸附免疫熒光技術(shù)，此技術(shù)是在顯微鏡載玻片上固定抗菌抗體和未致敏紅細胞，其中抗體吸附病原菌，紅細胞僅作為熒光顯微鏡鏡檢的指示物。該技術(shù)與紅細胞吸附免疫熒光法相比敏感性更高，并且配制試劑更簡便，易于在基層單位推廣。

2.6 免疫擴散法

免疫擴散法（immunodiffusion，ID）是在抗原抗體的免疫沉淀反應(yīng)基礎(chǔ)上將瓊脂作為惰性載體，通過比較沉淀與抗原濃度的關(guān)系，可以定量檢測樣品中抗原（蛋白質(zhì)）含量。免疫擴散法包括環(huán)狀免疫單擴散法和雙向擴散法。FELDSINE P T等[24]將改良免疫擴散法與《細菌分析手冊》中方法進行比較來檢測生肉和高污染食品中的沙門氏菌，此改良免疫擴散法是加拿大農(nóng)業(yè)部建立的方法，目的是在保持檢測時間為2 d的同時，在42 ℃四硫磺酸鈉煌綠肉湯中添加高溫選擇性富集步驟。在所檢測的320個樣品中，使用改良免疫擴散法和《細菌分析手冊》培養(yǎng)方法的假陰性率分別為5.2%和3.5%，總體一致性達96.9%。GAST R K等[25]分別用熒光偏振和側(cè)向流免疫擴散法來檢測孵化的雞蛋內(nèi)容物中腸炎沙門氏菌，結(jié)果顯示兩種方法在雞蛋內(nèi)容物中檢出限均為108CFU/mL（大多數(shù)為107CFU/mL），雖然快速檢測的靈敏度明顯低于培養(yǎng)法，但是用10 CFU腸炎沙門氏菌感染10個雞蛋并在25 ℃孵育72 h時，快速檢測法和培養(yǎng)法都可以檢測到病原菌。

2.7 免疫傳感器法

免疫傳感器法（immunosensor assay，IA）是根據(jù)抗原抗體的特異性反應(yīng)，將抗原（抗體）作為感應(yīng)元件與信號傳導(dǎo)器相結(jié)合，通過反應(yīng)待測抗體（抗原）的濃度來檢測目標物質(zhì)的一種方法。該方法特異性強、靈敏度高。陳晨等[26]在納米金和石墨烯共沉積的絲網(wǎng)印刷碳電極表面用雙抗體夾心法建立了一個電化學(xué)免疫傳感器來進行沙門氏菌的快速檢測，該傳感器具有特異、穩(wěn)定的優(yōu)點，檢出限為1.18×102CFU/mL。胡雨欣[27]采用免疫磁納米粒子進行腸炎沙門氏菌的高效富集，并和雙通道等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器偶合起來，建立了一種以SPR傳感器進行腸炎沙門氏菌檢測的新方法，該方法特異性強、準確度高，檢測限為1.4 CFU/mL。馬駿爽等[28]將納米金、氧化石墨烯、氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料、氧化石墨烯/離子液體以電沉積方法分別修飾到絲網(wǎng)印刷電極上，并與酶標抗體結(jié)合制備成四種免疫傳感器，綜合比對后結(jié)果顯示在免疫傳感器的各項指標尤其是準確性和重現(xiàn)性方面離子液體和納米金材料明顯優(yōu)于其他材料。

2.8 免疫色譜技術(shù)

免疫色譜技術(shù)（immunochromatographic technique，ICT）是以抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)。該方法首先在柱填料中偶聯(lián)抗原（抗體）來制備親和層析柱，當樣品通過層析柱后，就可以從混合樣品中將與抗原（抗體）特異性結(jié)合的免疫成分分離純化出來。免疫色譜法在近30年來發(fā)展迅速，具有高效、快速、安全的優(yōu)點，該方法選擇性最高并且分離純化最有效。YEUNG C Y等[29]建立了一種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）探針-金納米顆粒免疫色譜法來檢測樣品中沙門氏菌的16S核糖體DNA，并將該方法與VITEK 2系統(tǒng)進行確認比較，結(jié)果顯示該方法檢測159份樣品的敏感性為100%，特異性為94.93%，DNA純化后的檢測時間僅為30 min，是一種方便、快速、成本低的檢測方法。BAUTISTA D A等[30]評估了基于免疫色譜的試紙條檢測家禽中沙門氏菌的敏感性和特異性，當使用不同沙門氏菌菌種的純菌落時分析靈敏度為1×104～1×105CFU/mL；當直接檢測鼠傷寒沙門氏菌感染的雞糞便時敏感性為12.3%，特異性為100%；與XLT4選擇性培養(yǎng)基相比當樣品在2%BPW中預(yù)增菌后敏感性和特異性分別增加至93.8%和89%；隨后用TT肉湯增菌后敏感性和特異性分別提高至94.7%和96.8%。與在XLT4選擇性培養(yǎng)基分離病原菌相比，該試紙條檢測法在預(yù)增菌和增菌步驟會縮短18～48 h。

3 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的逐漸發(fā)展，人們對生物體的認識已經(jīng)到達微觀水平，通過檢測病原微生物的核酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)，來進行不同致病微生物、同一微生物不同抗原類型的分離鑒定[31]。許多沙門氏菌分子生物學(xué)檢測方法以其快速、靈敏、特異的優(yōu)點也逐漸被廣泛應(yīng)用。

3.1 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是一項體外基因擴增技術(shù)，是由美國的MULLIS K等在1985年首次建立的[9]，具有檢測快速、特異性強、敏感性高[10]的優(yōu)點，是一種目前廣泛應(yīng)用的檢測方法，但是操作比較復(fù)雜，檢測結(jié)果不太穩(wěn)定。常用的PCR檢測方法包括多重PCR法、熒光定量PCR法、免疫PCR法等。趙新等[32]以沙門氏菌invA基因作為目的基因，建立了檢測沙門氏菌微滴數(shù)字PCR定量檢測法，此方法不需要構(gòu)建質(zhì)粒和標準曲線，可以快速、靈敏、準確地檢測沙門氏菌含量。王青龍等[33]建立了實時熒光PCR來檢測食品中的亞利桑那沙門氏菌，特異性很好，檢測靈敏度為1～10 CFU/mL。PRASHANT S等[34]建立了雙重實時熒光PCR來檢測牛肉制品中大腸桿菌（Escherichia coli）、stx1、stx2基因和沙門氏菌（Salmonella），此方法利用內(nèi)標形成具有高分辨率的兩個溶解曲線，檢測結(jié)果重復(fù)性好、準確性高、成本低廉。程玲玲等[35]設(shè)計并篩選出三對特異性引物來進行雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）檢測，并且經(jīng)條件優(yōu)化得到一種含兩種DNA聚合酶的三重PCR反應(yīng)體系，該體系可以實現(xiàn)免核酸提取的直接PCR，檢測靈敏性高，檢出限＜1 000 CFU/mL。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是2000年NOTOMI T等[36]開發(fā)的一種新型恒溫核酸擴增方法，其原理是針對靶基因的六個區(qū)域設(shè)計四種特異性引物，利用一種鏈置換脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶在等溫條件（63 ℃左右）保溫30～60 min，即可完成核酸擴增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，LAMP具有簡單、靈敏、成本低的特點，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳等過程[10]，適用于高通量檢測，但是對引物設(shè)計要求比較嚴格[37-38]。LI J等[39]建立了食品中沙門氏菌特異性基因62181533的LAMP法，檢出限為4.1 CFU/mL，具有高度特異性和靈敏性，檢測時間＜1 h。該檢測技術(shù)的特異性、靈敏性和檢測范圍與PCR技術(shù)一致甚至更高，檢測成本較低，但是由于實驗環(huán)境、樣品中病原菌的多樣性容易產(chǎn)生不穩(wěn)定結(jié)果。郭澍強等[40]建立了以沙門氏菌invA基因為目的片段的LAMP檢測方法，該方法靈敏度為10CFU/mL，具有快速、費用低、特異性好的優(yōu)點，可以快速檢測食品樣品和動物中6個腸道沙門氏菌亞種。張?zhí)焯淼萚41]根據(jù)沙門氏菌invA基因設(shè)計引物，在樣品前處理時結(jié)合疊氮溴化乙錠、蒙脫石封閉的活性炭，建立了一種牛奶中活沙門氏菌的非預(yù)增菌實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法。該方法的靈敏度為10 CFU/mL，與國標檢測法相比更快速、靈敏。

3.3 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)的原理是堿基配對，核酸探針是指帶有標記物的能識別特定核酸序列的脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）片段[42]，它能與其互補的核酸序列雜交形成雙鏈，可以用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。此技術(shù)具有快速、特異、敏感的特點[43]，已經(jīng)應(yīng)用于一些病原微生物的檢測和研究。目前已經(jīng)用于病原檢測的核酸探針有基因組DNA探針、互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）分子探針和近些年來開發(fā)出來的如TaqMan探針、分子信標等寡核苷酸探針。ALMEIDA C等[44]利用新型肽核酸探針結(jié)合熒光原位雜交來檢測水、奶粉、糞便中的沙門氏菌，準確度達到100%。袁慕云等[45]建立了基于TaqMan探針的沙門氏菌雙重實時熒光PCR檢測方法，實現(xiàn)了對腸炎沙門氏菌和腸道沙門氏菌的同時檢測，該方法具有高靈敏度和強特異性，腸炎沙門氏菌和腸道沙門氏菌的檢測限分別為260 CFU/mL和280 CFU/mL。ISABEL M等[43]篩選出了Sal-3和Sal-5兩個核酸序列作為檢測沙門氏菌的探針，Sal-3探針在鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌培養(yǎng)液中的檢測限（limit of detection，LOD）值分別為105CFU/mL和104CFU/mL，Sal-5探針的檢測限稍高于Sal-3探針，分別為104CFU/mL和104CFU/mL，檢測結(jié)果與PCR、ISO 6579標準方法一致。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片的基本原理是雜交測序法，是指標記樣品DNA與一組固定于支持物上的核酸探針雜交，通過分析雜交的信號強度獲得樣品DNA序列?；蛐酒?991年由美國學(xué)者FODOR S P[46]提出的。不同于PCR、免疫分析等只能檢測一種或較少的幾種微生物基因片段、操作過程復(fù)雜，基因芯片技術(shù)可以同時對大量基因片段進行分析[8]，具有特異性強、自動化以及高通量的優(yōu)點，是目前可用于多種微生物檢測的快速方法之一，但也存在實驗成本（探針合成、核酸標記、數(shù)據(jù)分析）較高、測定結(jié)果不穩(wěn)定等問題。許俊鋼[47]應(yīng)用基因芯片檢測了大腸菌群（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）和志賀氏菌（Shigella castellani）共30份樣品，結(jié)果顯示其準確率高，檢測時間在8 h內(nèi)，檢測效率顯著提高。LI Y[48]利用可視化DNA微矩陣技術(shù)結(jié)合多重PCR方法來檢測常見的致病菌，包括大腸菌群、沙門氏菌、志賀氏菌和單增李斯特菌，該實驗通過檢測包括沙門氏菌在內(nèi)的14種致病菌陽性的食品及菌液，結(jié)果顯示檢出限為102CFU/mL，是一種快速、特異、高通量的檢測方法。

3.5 擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)

擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)（amplified fragment length polymorphism，AFLP）的基本原理是先用限制性內(nèi)切酶進行基因組DNA的雙酶切，產(chǎn)生不同分子質(zhì)量大小的隨機DNA片段，再進行PCR擴增，根據(jù)不同長度的擴增片段進行多態(tài)性分析。此技術(shù)具有快速簡便、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點，在微生物研究方面的應(yīng)用較為廣泛[1]，但是對內(nèi)切酶質(zhì)量和DNA純度要求很嚴格。目前AFLP技術(shù)在沙門氏菌研究方面報道較少。有學(xué)者[1]對含有62個血清型的78株沙門氏菌菌株進行了AFLP指紋圖譜分析后，結(jié)果顯示每一個血清型都有獨特的AFLP指紋圖，并且AFLP指紋的分辨率較高，可以因此區(qū)分不同菌株。

4 新型檢測方法

4.1 生物傳感器檢測技術(shù)

生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)化為電信號進行檢測的儀器，是由固定化的生物分子識別元件（如微生物、細胞、組織、酶、抗原、抗體等生物活性物質(zhì)）、適當?shù)男盘栟D(zhuǎn)換器（如光敏管、氧電極、壓電晶體）及信號放大裝置組成的分析系統(tǒng)。目前用于檢測沙門氏菌的傳感器有酶傳感器、電化學(xué)傳感器、免疫傳感器、基因傳感器、光敏傳感器等[7]。生物傳感器具有準確度高、檢測速度快、操作簡便的優(yōu)點。嚴杏[49]建立了一種DNA適配體傳感器來檢測甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi）A，其基本原理是熒光疊加、熒光能量共振轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和限制性內(nèi)切酶酶解作用。其中限制性內(nèi)切酶I介導(dǎo)的靶標循環(huán)可以將熒光信號放大，當靶標濃度為1×102～1×1011cells/mL時，熒光強度的線性關(guān)系良好，檢測下限為1×102cells/mL，結(jié)果顯示該方法具有高度靈敏性和特異性。CHEN I H等[50]利用噬菌體包被的ME傳感器建立兩種檢測模式，以比較雞肉中沙門氏菌的檢測效果，結(jié)果表明在檢測雞肉表面時，添加了7.86×105CFU/mm2沙門氏菌的噬菌體C4-22傳感器與未添加的噬菌體對照傳感器相比顯示出12倍以上的沙門氏菌結(jié)合能力。王月等[51]利用生物素-脫氧核糖核苷三磷酸（biotin-deoxy-ribonucleoside triphosphate，B-dNTP）改良了沙門氏菌目的片段擴增產(chǎn)物，實現(xiàn)了以核酸橫流生物傳感器為檢測依據(jù)的沙門氏菌可視化檢測方法，該方法檢測快速、結(jié)果直觀，檢出限為10 CFU/mL。

4.2 納米技術(shù)

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm）的材料[52]，具有小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)的基本特征。將納米材料與電子材料、生物學(xué)結(jié)合起來，就可以利用如酶、抗體等特定識別分子來分析待測樣品，并產(chǎn)生特定信號。納米材料應(yīng)用于食品中致病菌檢測方面的技術(shù)包括納米生物傳感器技術(shù)、納米金免疫標記技術(shù)、納米磁分離技術(shù)等。納米材料如氧化石墨烯、碳納米管、等離子體金、磁珠等被用作生物傳感器的傳感部分，已經(jīng)應(yīng)用于致病菌的檢測[53]。將納米技術(shù)與常規(guī)檢測技術(shù)相結(jié)合，具有大批量檢測、方便快捷、靈敏度高[8]的優(yōu)點，但是對檢測成本和技術(shù)水平要求較高。徐連應(yīng)等[54]建立了一種基于復(fù)合納米材料和酶切信號的電化學(xué)傳感器，已經(jīng)成功檢測出羊奶中的沙門氏菌，檢測敏感性為200 CFU/mL，具有檢測限低、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點，有望應(yīng)用于食品中沙門氏菌的快速定量檢測。LIU X等[55]利用夾心免疫分析法原理，將免疫傳感器結(jié)合抗體修飾Fe3O4磁性納米（immunosensor combining antibody-functionalized Fe3O4magnetic nanoparticles，immuno MNPs）構(gòu)建了一個表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器，用于腸炎沙門氏菌的快速檢測。此方法的檢測限為14 CFU/mL，與immunoMNPs結(jié)合的SPR免疫傳感器與腸炎沙門氏菌常規(guī)SPR傳感器相比，其靈敏度提高了4個數(shù)量級。該實驗構(gòu)建的SRP傳感器具有成本低、簡便、高度敏感的特點，有望成為食品中致病菌檢測的新方法。肖穩(wěn)等[56]研究了一種羧甲基殼聚糖-分子信標-金納米合成材料，根據(jù)以分子信標共價功能化為基礎(chǔ)的殼聚糖技術(shù)，利用金納米比色方法來進行鼠傷寒沙門氏菌SSeC基因的檢測，該方法的靈敏度和特異性較高，對目的基因的檢測下限為50 nmol/L。

4.3 基于適配體的檢測技術(shù)

適配體是采用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從人工合成的隨機文庫中篩選出的一段寡核苷酸序列，該序列對相應(yīng)的配體具有高度親和力和特異性。核酸適配體作為一種新型識別分子，具有制備方便、可體外化學(xué)合成、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[57]，并且比抗體的制備周期短、特異性高，但是該技術(shù)目前檢測的致病菌種類比較少，實現(xiàn)高通量檢測還存在較大難度[58]。近年來已經(jīng)篩選出多種致病菌的適配體并應(yīng)用于食品檢測，基于適配體檢測食品中沙門氏菌的技術(shù)也在逐漸發(fā)展。段諾[59]首先將適配體、磁性納米顆粒、雙色上轉(zhuǎn)換納米顆粒分別作為識別元件、捕獲探針和顯示探針，與上轉(zhuǎn)換激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)結(jié)合起來，建立了一種同時檢測沙門氏菌和金黃色葡萄菌的方法，鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測限分別為5 CFU/mL和8 CFU/mL；其次基于適配體識別和量子點熒光標記技術(shù)，并與流式細胞術(shù)相結(jié)合，建立了同時檢測沙門氏菌和副溶血性弧菌的方法，結(jié)果顯示該方法與平板計數(shù)法無顯著差異；最后根據(jù)AccuBlue染料具有弱熒光強度，結(jié)合雙鏈DNA后產(chǎn)生高熒光強度，結(jié)合單鏈DNA后熒光強度無明顯變化，建立了無標記熒光適配體傳感器，分別實現(xiàn)了沙門氏菌和副溶血性弧菌的檢測，檢測限為25 CFU/mL、35 CFU/mL。賈飛[60]首先基于適配體識別和還原氧化石墨烯-納米金制備了新型電流型傳感器，對食品中沙門氏菌進行檢測，檢測限為80 CFU/mL（S/N=3）；其次利用一步電沉積法還原氧化石墨烯-碳納米管復(fù)合納米材料，構(gòu)建了基于適配體的新型無標記電化學(xué)傳感器來檢測沙門氏菌，檢出限為25 CFU/mL（S/N=3）。蔣曉華等[61]根據(jù)合成的金屬有機骨架材料（Uio-66-NH2）的熒光猝滅特性和適配體的識別作用，制備了熒光生物傳感器來檢測蝦肉樣品中的沙門氏菌，該傳感器的靈敏度、特異性較好，檢出限（S/N=3）為7 CFU/mL。

5 結(jié)論與展望

食品中微生物檢測對于保證人們的飲食健康有重要意義，尤其是近年來致病菌感染受到了人們的廣泛關(guān)注。沙門氏菌作為常見的致病菌在畜禽類及其制品中的感染逐漸增多，沙門氏菌檢測方法也在不斷發(fā)展。

最常用的沙門氏菌檢測技術(shù)有傳統(tǒng)生理生化檢測法、免疫學(xué)檢測法和分子生物學(xué)檢測法。傳統(tǒng)生理生化檢測方法的準確度高，穩(wěn)定性好，檢測成本低，但是操作復(fù)雜，檢測周期長，不能進行現(xiàn)場檢測，目前該方法仍然是國際標準化組織認可的沙門氏菌檢測金標準。免疫學(xué)檢測方法的檢測靈敏度高、檢測批量多、檢測速度快，能夠廣泛應(yīng)用到沙門氏菌檢測中，但是操作中多次洗滌容易引起交叉污染和假陽性，檢測結(jié)果主要由一抗的質(zhì)量決定，而一抗的制備需要大量時間去摸索，并且目前無法檢測所有的沙門氏菌血清型。分子生物學(xué)檢測方法的靈敏度高、特異性強、檢測快速，但是所需的儀器費用高，對檢測人員、檢測條件和環(huán)境的要求比較嚴格，如PCR技術(shù)在引物設(shè)計、操作環(huán)境方面容易引起不穩(wěn)定結(jié)果；基因芯片的標記技術(shù)、增強芯片檢測靈敏性等技術(shù)問題需要進一步優(yōu)化。生物傳感器技術(shù)、納米技術(shù)、基于適配體檢測技術(shù)等新型檢測技術(shù)為建立沙門氏菌快速檢測方法提供了技術(shù)支撐，但是存在技術(shù)要求嚴格、實驗成本高等問題，其中基于適配體的檢測技術(shù)還需要提高適配體篩選效率、研究適配體與靶分子的結(jié)和作用機制。

聯(lián)合使用兩種或兩種以上方法能適當彌補單一檢測技術(shù)產(chǎn)生的缺陷，將傳統(tǒng)的生化檢測技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來用于致病菌的檢測，才能提高病原微生物的研究和檢測水平。將一些新型技術(shù)與常規(guī)檢測方法聯(lián)合使用，促進了沙門氏菌檢測技術(shù)的快速發(fā)展。目前由于高技術(shù)要求、成本費用高等原因，大多數(shù)新型檢測技術(shù)僅在實驗室研究階段。一項快速檢測技術(shù)能否得到廣泛應(yīng)用，除了檢測快速、結(jié)果準確、特異性強等優(yōu)點外，還與成本較低、接近實際應(yīng)用有關(guān)。隨著人們對食品安全的密切關(guān)注和食品衛(wèi)生監(jiān)管的快速檢測要求，開發(fā)靈敏度高、快速準確、成本較低、操作簡便的檢測方法是今后檢測食品中沙門氏菌的重要研究方向。