橡膠樹(shù)橡膠生物合成調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)性分析

楊署光 楊秀光 趙悅 史敏晶 李言 鄧小敏 晁金泉 田維敏

摘?要：該文通過(guò)qPCR獲得了正常割膠條件下，9個(gè)茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)基因HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3、HbMYC4、HbMYC5和6個(gè)橡膠生物合成相關(guān)基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5個(gè)橡膠樹(shù)魏克漢種質(zhì)和5個(gè)1981IRRDB種質(zhì)膠乳中的表達(dá)數(shù)據(jù);通過(guò)皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析了這15個(gè)基因彼此間的表達(dá)相關(guān)性，分別獲得105對(duì)基因的雙變量相關(guān)系數(shù)（r12）和偏相關(guān)系數(shù)（r12.3），所有105對(duì)基因的雙變量相關(guān)系數(shù)（︱r12︱）和偏相關(guān)系數(shù)（︱r12.3︱）的平均值分別為0.486 ± 0.220和0.304 ± 0.211，達(dá)到0.05的差異顯著水平。其中，r12與r12.3方向相同的63對(duì)（60%），方向相反的42對(duì)（40%）;︱r12︱<︱r12.3︱的23對(duì)（21.905%），︱r12︱>︱r12.3︱的82對(duì)（78.095%）;雙變量相關(guān)顯著性P<0.05的76對(duì)（72.38%），P<0.01的59對(duì)（56.19%）;偏相關(guān)顯著性P<0.05的21對(duì)（20%），P<0.01的16對(duì)（15.24%）。結(jié)果顯示，這兩條途徑中的基因表達(dá)彼此相關(guān)，這為基因表達(dá)譜分析中普遍采用的前提假設(shè)“功能相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)”提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，可用于挖掘、篩選和預(yù)測(cè)與橡膠生物合成相關(guān)的未知基因，為研究橡膠樹(shù)產(chǎn)量形成的分子調(diào)控機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù)， 割膠， 茉莉酸信號(hào)途徑， 橡膠生物合成， 基因表達(dá)， Pearson相關(guān)

中圖分類號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）12-1790-10

Abstract：Tapping-enhanced rubber biosynthesis is closely related to the activation of jasmonic acid signaling in laticifer cells of rubber tree.The expression level of genes related to jasmonic acid signaling pathway and rubber biosynthesis were both positively correlated with the dry rubber yield.However， the exact relationship between the expression of genes involved in jasmonic acid signaling and rubber biosynthesis is not to be elucidated yet.In the present study， qPCR was used to analyze the expression of nine jasmonic acid signaling genes， HbCOI1， HbJAZ1， HbJAZ2， HbJAZ3， HbMYC1， HbMYC2， HbMYC3， HbMYC4， HbMYC5 and six rubber biosynthesis genes， HbHRT2， HbSRPP， HbREF， HbHMGR1， HbHRT1， HbGAPDH， in laticifer cells of five Wichham germplasms and five 1981IRRDB germplasms following tapping them with S/2D d3 tapping system， Hb18S was used as internal reference gene.The correlation between these 15 genes was analyzed through Pearson correlation coefficient.The bivariate correlation coefficient （r12） and partial correlation coefficient （r12.3） of 105 gene pairs were obtained with the mean ± standard deviation of 0.486 ± 0.220 and 0.304 ± 0.211， respectively.Among them， 63 gene pairs （60%） with r12 in the same direction as r12.3 and 42 genes pairs （40%） in the opposite direction; In the degree of correlation， 23 gene pairs （21.905%） with | r12 | less than | r12.3 |， and 82 gene pairs （78.095%） with | r12 | greater than | r12.3 |.There 76 gene pairs （72.38%） bivariate correlation coefficient （r12） were significant correlation at P<0.05 level and 59 gene pairs （56.19%） at P<0.01 level.In contrast， there less partial correlation coefficient （r12.3） were significant correlation at P<0.05 level （21pairs， 20%） and P<0.01 level （16 pairs， 15.24%）.These results suggested that the expression of genes involved in these two pathways were related to each other， which provides a further evidence for the assumption that “expression correlation of functional related genes”， which is widely adopted in gene expression profile analysis.It can be used for excavating， screening and predicting unknown genes related to rubber biosynthesis， as well as provides a theoretical basis for studying the molecular regulation mechanism of rubber yield formation in Hevea brasiliensis.

Key words：Hevea brasiliensis， tapping， jasmonate signaling， rubber biosynthesis， gene expression， Pearson correlation

茉莉酸是植物逆境響應(yīng)的關(guān)鍵激素信號(hào)（Qi et al.， 2011），COI1、JAZ和MYC是茉莉酸信號(hào)途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（Chini et al.， 2009）;JA-Ile、COI1、JAZ和MYC通過(guò)精細(xì)的互作（Donnell et al.， 1996; Chini et al.， 2007; Fonseca et al.， 2009; Qi et al.， 2011）參與植物次生代謝的調(diào)節(jié)（Qi et al.， 2011; Schweizer et al.， 2013）。巴西橡膠樹(shù)中的天然橡膠生物合成是一種典型的植物類異戊二烯代謝，受茉莉酸信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)（Deng et al.， 2018）;橡膠生物合成途徑包括一系列橡膠生物合成關(guān)鍵酶（Koyama & Tanaka， 1996），如REF（Dennis & Light， 1989）、HMGR（Chye et al.， 1992）、HRT（Asawatreratanakul et al.， 2003）、SRPP（Collins， 2009）等;茉莉酸信號(hào)途徑對(duì)這些酶的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚。橡膠樹(shù)種質(zhì)PR107、RRIM600、熱墾628、熱墾525和熱墾523的干膠產(chǎn)量普遍高于RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107和RO/CM/10 44/454，并且茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)基因HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3、HbMYC4、HbMYC5的表達(dá)和橡膠生物合成酶基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH的表達(dá)與他們的橡膠產(chǎn)量正相關(guān)（楊署光等，2019a，b）。但是，這些基因表達(dá)的株間差異以及這些基因間的表達(dá)相關(guān)性尚不清楚。本研究通過(guò)分析這些基因在這10份種質(zhì)中的表達(dá)相關(guān)性，可為研究橡膠樹(shù)產(chǎn)量形成的分子調(diào)控機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料

10份巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）種質(zhì)、試劑、耗材與先前的報(bào)道相同（楊署光等，2019a，b）。其中，RO/C/8 24/104為2株、RO/I/103 107為4株，其他種質(zhì)各3株，共30株樹(shù)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理?生產(chǎn)中按S/2D d3正常割膠，在8月份的某次割膠時(shí)，分別收集前10 min流出的膠乳，用于提取膠乳總RNA。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA的合成

用曾日中等（2003）的方法提取膠乳總RNA。cDNA第一鏈的合成與先前的報(bào)道相同（楊署光等，2019a，b）。

1.2.3 基因表達(dá)分析

1.2.3.1 qPCR引物合成?引物為序列來(lái)自文獻(xiàn)（Tian et al.， 2013;楊署光等，2019a，b），委托Invitrogen公司合成。

1.2.3.2 qPCR反應(yīng)?qPCR反應(yīng)按先前報(bào)道的方法完成（楊署光等，2019a，b）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Hb18S作內(nèi)參，按先前報(bào)道的方法（楊署光等，2019a，b）計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)值。用SPSS軟件分析基因表達(dá)值的Pearson 相關(guān)性，P<0.01表示極顯著相關(guān)，P<0.05表示顯著相關(guān);相關(guān)性的密切程度參照文獻(xiàn)報(bào)道（朱婉麗，2019）的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)相關(guān)系數(shù)（r）的數(shù)值大小，分為四個(gè)等級(jí)：0<|r︱≤0.3為微弱相關(guān);0.3<︱r︱≤0.5為低度相關(guān);0.5<︱r︱≤0.8為中度相關(guān);0.8<︱r︱≤1為高度相關(guān)。

分別用SPSS軟件的Duncan檢驗(yàn)和Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 2，Type 2）完成多重比較分析和雙樣本比較分析：P<0.01表示組間差異極顯著，P<0.05表示組間差異顯著。用GraphPad Prism 5作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹(shù)種質(zhì)膠乳中橡膠生物合成調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)分析

qPCR分析表明，不同種質(zhì)中的基因表達(dá)差異明顯，相同種質(zhì)的生物學(xué)重復(fù)間也能達(dá)到極顯著差異，并且高產(chǎn)種質(zhì)中的基因表達(dá)普遍高于低產(chǎn)種質(zhì)（圖1、圖2）。在高低產(chǎn)種質(zhì)組間，COI1（圖1：A）、JAZ1（圖1：B）、JAZ2（圖1：C）、JAZ3（圖1：D）、MYC1（圖1：E）、MYC2（圖1：F）、MYC3（圖1：G）、MYC5（圖2：I）、GAPDH（圖2：J）、HMGR1（圖2：K）、REF（圖2：M）、HRT2（圖2：O）差異極顯著，HRT1（圖2：N）差異顯著，SRPP（圖2：L）差異不大，MYC4（圖1：H）差異不顯著;高低產(chǎn)之比分別為1.74、1.84、2.17、3.73、2.58、2.38、8.72、0.34、2.58、1.36、2.28、3.02、1.84、1.36、1.01。15個(gè)基因在高低產(chǎn)種質(zhì)組間的平均表達(dá)差異極顯著，兩者之比為2.08（圖2：P）。

2.2 橡膠樹(shù)種質(zhì)膠乳中橡膠生物合成調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析

共分析了15個(gè)基因間的表達(dá)相關(guān)性，分別獲得105對(duì)基因的雙變量相關(guān)系數(shù)（r12）和偏相關(guān)系數(shù)（r12.3）（圖3、圖4）。其中，r12與r12.3方向相同的占60%，相反的占40%;微弱相關(guān)、低度相關(guān)、中度相關(guān)、高度相關(guān)的r12分別為20.952%、 33.333%、37.143%、8.571%，在r12.3中分別為54.286%、22.667%、18.095%、0.952%;︱r12︱<︱r12.3︱的為21.905%，︱r12︱>︱r12.3︱的為78.095%;顯著相關(guān)和極顯著相關(guān)的r12分別為72.38%和56.19%，在r12.3中分別為20%和15.24%;在30個(gè)植株中，9個(gè)茉莉酸信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)的平均值與6個(gè)橡膠生物合成相關(guān)基因表達(dá)的平均值間的r12為0.892，極顯著正相關(guān)。

分析了單個(gè)基因分別與其余14個(gè)基因間Pearson 相關(guān)系數(shù)的平均值（圖4：P）。所有105對(duì)基因的︱r12︱和︱r12.3︱的平均值分別為0.486和0.304，兩者差異顯著;HRT2、REF、COI1、JAZ1、JAZ3、MYC1、GAPDH、MYC2、MYC3的︱r12︱與︱r12.3︱差異顯著，而HMGR1、SRPP、HRT1、JAZ2、MYC4、MYC5的︱r12︱與︱r12.3︱差異不顯著;各組中︱r12︱普遍大于︱r12.3︱，但彼此間的差異顯著性具有廣泛的交集;5個(gè)MYC家族

成員中，MYC1，2，3與其他14個(gè)基因的相關(guān)性相當(dāng)，且極顯著高于MYC4，5;3個(gè)JAZ家族成員中，JAZ1，2，3與其他14個(gè)基因的相關(guān)性差異不大，僅JAZ1，2間的︱r12︱達(dá)到0.05的顯著水平;相對(duì)而言，REF、GAPDH、MYC1、MYC2和MYC3與其他14個(gè)基因的相關(guān)性高于MYC4和MYC5。

3?討論與結(jié)論

橡膠樹(shù)的橡膠生物合成是一種典型的植物類異戊二烯代謝，茉莉酸信號(hào)途徑與類異戊二烯代因的表達(dá)與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性;同時(shí)，該研究結(jié)果顯示，這兩條途徑中的基因表達(dá)彼此間具有一定的相關(guān)性，說(shuō)明功能相關(guān)的蛋白，基因表達(dá)傾向相關(guān);這為基因表達(dá)譜分析中普遍采用的前提假設(shè)“功能相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)”提供了理論依據(jù)，可用于挖掘、篩選和預(yù)測(cè)與橡膠生物合成相關(guān)的未知基因，為研究橡膠樹(shù)產(chǎn)量形成的分子調(diào)控機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

從多個(gè)角度研究了“功能相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)”這一現(xiàn)象。在線蟲(chóng)（Roy et al.， 2002; Lercher et al.， 2003）、酵母（Cohen et al.， 2000; 王晨光等，2006）、果蠅（Spellman & Rubin，2002）和人類（Lercher et al.， 2002;郭政等，2003）等不同物種上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了染色體上鄰近基因表達(dá)相關(guān)這一現(xiàn)象。酵母中互作蛋白質(zhì)的編碼基因（王磊等，2004;王晨光等，2006;歐陽(yáng)玉梅，2008）、蛋白質(zhì)復(fù)合物的編碼基因（Jansen et al.， 2002;王磊等，2004）表達(dá)顯著相關(guān)，并且功能聯(lián)系越強(qiáng)基因表達(dá)相關(guān)性越高（王磊等，2004），相互作用蛋白質(zhì)更傾向于對(duì)具有相同的亞細(xì)胞定位（王晨光等，2006;歐陽(yáng)玉梅，2008）;對(duì)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的分析表明，同一代謝通路上的基因表達(dá)傾向于高度相關(guān)（Harris et al.， 2004; Kanehisa et al.， 2004;Curtis et al.， 2005），在酵母（李傳星等，2004;王晨光等，2006）和狗（華琳等，2008）的研究中進(jìn)一步證實(shí)了這種相關(guān)性。以上結(jié)果表明真核生物中的基因存在模塊化的共表達(dá)趨勢(shì)。

“功能相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)”具有實(shí)驗(yàn)條件依賴性：不同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)這種相關(guān)性有一定的影響（Bader et al.， 2004;王晨光等，2006）。橡膠生物合成途徑中也存在類似的實(shí)驗(yàn)條件依賴性，如在該研究的S/2D d3的割膠制度下，MYC1和MYC2顯著正偏相關(guān)，而在S/2D d1的割膠制度下相反（Zhao et al.， 2011）。研究基因組內(nèi)和跨基因組的基因表達(dá)譜與蛋白質(zhì)相互作用之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與人類、小鼠等物種相比，酵母的蛋白質(zhì)相互作用與基因表達(dá)譜的相關(guān)性最弱（Bhardwaj & Lu， 2005），推測(cè)“功能相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)”具有進(jìn)化程度依賴性。

“HbCOI1-HbJAZs-HbMYCs”彼此間、家族成員間以及他們與FPS、SRPP、REF、HRT2等橡膠生物合成關(guān)鍵酶的相互作用（馬弗明， 2010;趙悅，2011;劉偉，2011;何鑫， 2013;包杰，2014;肖華，2015;王靖等，2016;姚笛，2016;鄧小敏等， 2018;Deng et al， 2018）表明他們?cè)谡{(diào)控橡膠生物合成過(guò)程中具有協(xié)同作用，為這些基因的表達(dá)相關(guān)性提供了理化基礎(chǔ)。

橡膠樹(shù)的產(chǎn)量性狀是一種典型的次生產(chǎn)量性狀，由反復(fù)合理的收獲脅迫（割膠）形成，是一個(gè)“形成-收獲-再形成-再收獲……”的過(guò)程（林位夫，2012）;2次割膠之間的橡膠再生以及相關(guān)基因的表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程;由于基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)性、瞬時(shí)性、多樣性和復(fù)合性，不同mRNA 的穩(wěn)定性和降解速率不同，可能會(huì)影響特定實(shí)驗(yàn)條件下的基因表達(dá)水平（Kruglyak & Tang， 2000）。因此，系統(tǒng)追蹤這些相關(guān)基因在排膠過(guò)程中的表達(dá)相關(guān)性是今后的一個(gè)研究方向。

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（責(zé)任編輯?李?莉）