濃香型白酒地域性及窖泥微生物研究進(jìn)展

梁 歡，許長(zhǎng)峰，朱立寧，唐偉斌

（1.邢臺(tái)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 邢臺(tái) 054001；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050200；3.河北鳳來(lái)儀酒業(yè)有限公司，河北 寧晉 055550）

作為世界六大蒸餾酒之一，中國(guó)白酒以其獨(dú)一無(wú)二的風(fēng)味著稱于世。其釀造的原料、工藝和環(huán)境的差異，造就了眾多的白酒香型。十二種常見(jiàn)香型中，濃香型憑借著超過(guò)七成的消費(fèi)量和最廣闊的生產(chǎn)分布區(qū)域而成為了白酒中的佼佼者。泥窖發(fā)酵是濃香型白酒的基礎(chǔ)工藝，窖泥上多年富集的微生物種群產(chǎn)生了酒體的呈香物質(zhì)。各地生產(chǎn)的濃香型白酒雖然工藝相近，但香味風(fēng)格存異，皆因菌群使然。眾多濃香型白酒釀造企業(yè)的生存和發(fā)展與質(zhì)量和特色休戚相關(guān)。地域性是與生俱來(lái)、無(wú)法復(fù)制的優(yōu)勢(shì)。本文總結(jié)濃香型白酒風(fēng)味特征的地域劃分，綜述窖泥品質(zhì)、窖泥微生物研究現(xiàn)狀，以期為厘清菌群地域差別、培植地方小眾濃香型白酒的鄉(xiāng)土優(yōu)勢(shì)、振興北方濃香型白酒提供參考。

1 濃香型白酒的地域性

與醬香型白酒茅臺(tái)的“一枝獨(dú)秀”相比，以五糧液、瀘州老窖、劍南春、洋河、古井等品牌為代表的濃香型白酒則可謂是“四處開(kāi)花”。由于濃香型白酒具有香氣濃郁、醇甜濃厚、協(xié)調(diào)凈爽而深得民心，市場(chǎng)需求巨量，各地均有釀造生產(chǎn)。1992年，沈怡方[1]首提“四川”和“蘇、皖、魯、豫”兩個(gè)地域所產(chǎn)濃香型白酒的風(fēng)味區(qū)別，并上升到流派高度。范廣璞等[2]論證了原料、工藝和地理環(huán)境不同導(dǎo)致主要微量香味成分差異，最終體現(xiàn)在酒體的特征上，將產(chǎn)于四川區(qū)域的濃香型白酒定義為“川派”，產(chǎn)于蘇魯皖豫地區(qū)的定義為“秦淮派”。李維青[3]認(rèn)為不同地域的生態(tài)環(huán)境引發(fā)釀酒微生物區(qū)系不同，加之原輔料、工藝技術(shù)水平不同，所產(chǎn)濃香白酒風(fēng)格存在微妙或較為明顯差異，明確指出濃香型白酒具有明顯的地域性，并進(jìn)一步將濃香型白酒按生產(chǎn)地域分為“川、冀、江淮（黃淮）、北方……”。程偉等[4]劃分了白酒以流域?yàn)榧~帶所形成的聚集產(chǎn)區(qū)，研究了江淮地區(qū)自然環(huán)境對(duì)柔和型白酒品質(zhì)的影響，明確了其地域優(yōu)勢(shì)。于春濤等[5]研究證明濃香型白酒窖泥中細(xì)菌多樣性與其產(chǎn)區(qū)之間存在一定聯(lián)系。

大量研究表明，濃香型白酒具有明顯的地域性，正所謂“一方水土釀一方酒”。三分天下之論與所對(duì)應(yīng)的群山合圍的四川盆地、蜿蜒起伏的秦淮丘陵山崗、地勢(shì)平坦的北方平原地帶，以及涇渭分明的氣候、生態(tài)環(huán)境特征相吻合。雖然地域差異決定的原料、氣候環(huán)境、菌群資源的各異，又導(dǎo)致濃香型白酒酒體風(fēng)味的奇妙迥異，目前的地域性研究卻有著粗獷、簡(jiǎn)單之嫌。

2 濃香型白酒釀酒窖泥質(zhì)量的研究

泥窖實(shí)為濃香型白酒的魂魄。泥窖發(fā)酵是濃香白酒最重要的工藝環(huán)節(jié)之一。濃香型白酒香味形成與窖池息息相關(guān)，窖泥是酒體生香功能微生物的繁殖容器及載體。不同品牌都有自己獨(dú)有的窖泥來(lái)源，這也是濃香白酒地域性的重要表現(xiàn)。五糧液使用宜賓獨(dú)特的弱酸性黃泥黏土，瀘州老窖的窖泥采用瀘州附近五渡溪出產(chǎn)的細(xì)膩黃黏土，冀酒泥坑采用的則是河北寧晉黑龍港流域獨(dú)有之狗頭膠泥……總的來(lái)看，各種濃香酒的窖泥大多為膠黏土，分布于主產(chǎn)區(qū)及周邊。窖泥的黏性既滿足了保水不透氣的要求，又達(dá)到了附著在窖壁的效果。其原泥不僅含有氮、磷、鉀、鈣、鐵、鎂等成分，且隨著使用時(shí)間的增加，各元素還會(huì)在部位、種類、含量等水平發(fā)生變化[6]，表現(xiàn)出窖泥的優(yōu)劣和老熟程度。何宏魁等[7]采用常規(guī)分析檢測(cè)技術(shù)測(cè)定窖泥pH值和腐殖酸含量，研究其與細(xì)菌含量的相關(guān)性，推斷這兩項(xiàng)指標(biāo)可用于衡量窖泥微生物數(shù)量的理化指標(biāo)。

對(duì)窖泥質(zhì)量的評(píng)價(jià)研究，主要集中在窖泥對(duì)菌群的富集能力和對(duì)功能菌的時(shí)空篩選馴化?！熬坪萌珣{窖池老”，優(yōu)質(zhì)老熟的窖泥對(duì)酒質(zhì)的提高與穩(wěn)定至關(guān)重要[6]。由于不同酒企采用窖泥的獨(dú)特性，以及生產(chǎn)過(guò)程參數(shù)控制的不同，導(dǎo)致其理化指標(biāo)差異較大，需要建立企業(yè)級(jí)窖泥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和窖泥保養(yǎng)技術(shù)規(guī)范。

3 濃香型白酒窖泥微生物的研究方法與技術(shù)

濃香型白酒釀造過(guò)程的實(shí)質(zhì)是分別來(lái)自于環(huán)境、曲藥和窖泥的微生物，在窖池內(nèi)酒醅中發(fā)生的固、液、氣三維空間的物質(zhì)能量代謝過(guò)程。窖泥中棲息著極其豐富的微生物區(qū)系。窖泥微生物的協(xié)同發(fā)酵為酒體香味物質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)化提供反應(yīng)底物，進(jìn)而奠定了濃香型白酒濃郁復(fù)合香氣的風(fēng)味特征基礎(chǔ)。

3.1 窖泥微生物研究方法

包括分離、純化、培養(yǎng)、鏡檢、理化性質(zhì)測(cè)定等環(huán)節(jié)在內(nèi)的傳統(tǒng)微生物研究方法，目前依然是研究釀酒窖泥微生物不可或缺的成熟技術(shù)，主要用于菌類的種類鑒定。由于自然界中只有0.1%～10%的微生物可以被直接培養(yǎng)[8]，大多數(shù)窖泥微生物難以利用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)和研究。20世紀(jì)90年代，源自分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、催化報(bào)告沉積-熒光原位雜交（catalyzed reporter deposition-fluorescence in situ hybridization，CARD-FISH）、磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）指紋圖譜等技術(shù)已經(jīng)在釀酒微生物研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。這些方法跳過(guò)分離培養(yǎng)環(huán)節(jié)，可通過(guò)直接檢測(cè)樣品中細(xì)菌總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）而確定窖泥微生物種類及豐度，避免了傳統(tǒng)微生物研究的局限性。近年來(lái)一經(jīng)推出就被快速推廣的高通量DNA測(cè)序技術(shù)——Illumina Solexa 合成測(cè)序，憑借對(duì)以百萬(wàn)計(jì)的原位DNA樣品分析產(chǎn)生遺傳信息，來(lái)同時(shí)分析樣本內(nèi)菌群豐度和樣本間菌群豐度差異。該技術(shù)能深度測(cè)序，大規(guī)模、高通量、短耗時(shí)，尤適分析復(fù)雜多菌種樣品，在生物、醫(yī)學(xué)、土壤、食品等領(lǐng)域研究中被廣泛應(yīng)用。在釀酒行業(yè)，高通量程序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于醬香、清香、濃香等香型的窖泥、大曲、酒醅、糙沙微生物群落的研究[9-13]。

3.2 釀酒微生物研究技術(shù)的應(yīng)用

白酒為中國(guó)特產(chǎn)。國(guó)外對(duì)白酒的研究目光主要集中在釀酒菌類的培養(yǎng)技術(shù)和分離鑒定技術(shù)的改進(jìn)方面。濃香型白酒發(fā)酵中產(chǎn)香己酸菌的研究起始于20世紀(jì)40年代。MUYZER G等[14]將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域，證實(shí)了此技術(shù)在解釋生物遺傳多樣性和種群多樣性差異方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。迄今為止微生物鑒定系統(tǒng)中最大的數(shù)據(jù)庫(kù)資源當(dāng)屬美國(guó)MIDI公司20世紀(jì)90年代研發(fā)出來(lái)的Sherlock MIS微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)[15]。ENDO A等[16]利用PCR-DGGE法檢測(cè)到了常規(guī)細(xì)菌檢測(cè)方法沒(méi)有檢測(cè)出的韓國(guó)燒酒釀造過(guò)程中含有的乳酸菌群。MADOROBA E等[17]采用DGGE法和常規(guī)分離方法對(duì)南非高粱自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌種群的多樣性和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了跟蹤分析，認(rèn)為這兩種技術(shù)的結(jié)合使用對(duì)揭示微生物的多樣性至關(guān)重要。FISH和CARDFISH均被用于改進(jìn)土壤微生物的檢測(cè)[18]，CARD-FISH相對(duì)更適合用于圖像分析研究。

國(guó)內(nèi)對(duì)濃香型白酒微生物的研究起步晚，但發(fā)展迅速。傳統(tǒng)的微生物分離分類鑒定技術(shù)在篩選、培養(yǎng)菌株[19]研究方面有所長(zhǎng)，但揭示釀酒微生物的多樣性則為短板。劉茂柯等[20-22]用變性梯度凝膠電泳分析窖泥放線菌和復(fù)合功能菌液群落結(jié)構(gòu)，魏娜等[22]的實(shí)驗(yàn)證明實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可用于窖泥微生物區(qū)系特定種群的快速定量檢測(cè)。具有準(zhǔn)確地表征、預(yù)測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)的高通量測(cè)序技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世即被廣泛應(yīng)用。李俊輝等[23-24]采用高通量測(cè)序技術(shù)分別分析研究了窖泥樣品中微生物與古菌群的群落結(jié)構(gòu)。五糧液[25]、瀘州老窖[26]、古井貢[27]、宋河糧液[28]、古襄陽(yáng)[29]等酒企分別利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖池中窖泥的微生物群落進(jìn)行了不同程度的解析。而利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)與現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合方法，韓穎[30]分離鑒定了窖泥中微生物群落，進(jìn)行了宏基因組測(cè)序。

4 窖泥微生物的種類組成與種群結(jié)構(gòu)研究

研究窖泥微生物的種類組成與群落結(jié)構(gòu)，對(duì)于揭示白酒釀造風(fēng)味機(jī)理、提質(zhì)增香具有相當(dāng)重要的作用。1964年，茅臺(tái)試點(diǎn)首次發(fā)現(xiàn)濃香型白酒主體香氣物質(zhì)是己酸乙酯，并成功地從窖泥中分離出與甲烷短桿菌共棲的鼓槌狀芽孢桿菌，經(jīng)一系列形態(tài)觀察及生理生化鑒定，確定了所分離的是己酸菌[31]。不完全統(tǒng)計(jì)，從窖泥中分離鑒定的釀酒功能菌已近百株。白酒品質(zhì)與這些微生物復(fù)雜的代謝活動(dòng)及代謝產(chǎn)物息息相關(guān)，其中己酸菌的主要代謝產(chǎn)物己酸乙酯是濃香型白酒酒體香味的主體[32]的論斷已經(jīng)成為共識(shí)。

綜合學(xué)者研究結(jié)果，窖泥微生物類群包含有細(xì)菌、霉菌、酵母菌、古生菌和放線菌等，大多數(shù)為細(xì)菌和古生菌。細(xì)菌從科水平而論，主要由鹽扁菌科（Haloplasmatacea）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、球菌科（Planococcaceae）、互營(yíng)單胞菌科（Synergistaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、嗜熱厭氧菌科（Thermoanaerbacteraceae）、梭菌科（Clostridiaceae）等組成。不同地域的窖泥中古生菌菌落趨于一致，主要由甲烷桿菌綱（Methanobacteria）的甲烷桿菌科（Methanobac teriaceae）和甲烷球菌綱（Methanococci），與熱源體綱（Thermoplasmata）的熱原體科（Thermoplasmataceae）構(gòu)成[33-34]。王春艷等[28]比較了濃香型白酒16年窖齡窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬為梭菌屬（Clostridium）、氨基酸桿菌屬（Aminobacterium）、理研菌屬（Petrimonas）、互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas）和消化鏈球菌屬（Sedimentibacter）。劉燕梅等[35]從濃香型白酒窖泥中篩選出對(duì)濃香型風(fēng)味的形成起著放香、助香及調(diào)香作用的球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）、塵埃類芽孢桿菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。趙輝等[36]對(duì)兼性厭氧細(xì)菌高產(chǎn)己酸菌進(jìn)行分離得到3株菌—巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和梭狀芽孢桿菌（B.fusiformis）。黃治國(guó)等[37]分離純化得到5株細(xì)菌，分別為微球菌屬（Mierococcus）、水稻細(xì)菌性古枯病菌屬（Burkholderiaglumae）、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococeus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）。甚至周艷等[38]對(duì)25年窖齡窖泥中的1株產(chǎn)丁酸菌株進(jìn)行了多相分類學(xué)研究，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該菌可能為毛螺旋菌科的一個(gè)新屬。張志偉等[39]在窖泥微生物的研究中發(fā)現(xiàn)不同年份窖泥中優(yōu)勢(shì)菌種差別較大，窖泥不同高度優(yōu)勢(shì)菌種也大有不同。羅杰等[40]研究發(fā)現(xiàn)，窖池中壁泥和底泥細(xì)菌種類及數(shù)量的差異性較大，認(rèn)為其細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性及相互之間存在差異。李紹亮等[41]研究認(rèn)為，就總數(shù)而言，窖泥中細(xì)菌、放線菌、酵母菌和芽孢桿菌隨著窖池窖齡的增加而增加，霉菌的變化較?。煌妖g窖泥，池底細(xì)菌高于池壁，池壁的放線菌和酵母菌高于池底。窖池所產(chǎn)原酒質(zhì)量隨窖齡的增加明顯提升。

5 結(jié)論與展望

總結(jié)目前濃香型白酒窖泥微生物的研究現(xiàn)狀，以下幾個(gè)特點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的。一是在窖泥微生物種類數(shù)量研究領(lǐng)域，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)仍在發(fā)揮著重要作用。人們熱衷于篩選鑒定影響酒體風(fēng)味的關(guān)鍵菌，并對(duì)其分離、培養(yǎng)、擴(kuò)繁，以功能菌復(fù)合菌制劑形式再返施窖泥，進(jìn)行窖泥的培熟、養(yǎng)護(hù)，以及變質(zhì)窖泥的處理[42]。這一技術(shù)還將繼續(xù)使用并發(fā)展改進(jìn)。但存在的問(wèn)題是，大型酒企憑借雄厚的實(shí)力起步較早，一些中小酒企則相對(duì)落后。企業(yè)依靠直接從科研院所和大酒企購(gòu)買(mǎi)功能菌制劑用于生產(chǎn)，易產(chǎn)生水土不服現(xiàn)象，降低效果。二是在窖泥菌群交替演化規(guī)律，以及環(huán)境、時(shí)空變化與菌群性質(zhì)功能的關(guān)系上，隨著現(xiàn)代研究技術(shù)的應(yīng)用，規(guī)律與關(guān)系日漸清晰，從微生態(tài)到車間環(huán)境，引導(dǎo)、改善釀造體系向著提質(zhì)降耗方向轉(zhuǎn)移成為了可能。同樣，知名酒企大眾品牌在這方面也走在前列。從而引出第三個(gè)方面，濃香型白酒的地域特性被掩蓋，發(fā)展不平衡。特別是北派濃香酒，地域廣，產(chǎn)區(qū)分散，大部分經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)，科技支撐度低，使得憑借獨(dú)特的歷史文化、地理氣候、工藝技藝而流傳繼承至今的地方品牌發(fā)展舉步維艱。

發(fā)展?jié)庀阈桶拙飘a(chǎn)業(yè)，重點(diǎn)在“香”，方向在“特”。在保持目前川派、秦淮派發(fā)展勢(shì)頭的前提下，做大做強(qiáng)北派濃香。一方面加強(qiáng)理念引導(dǎo)，凝練特色，借力川派的醇冽、秦淮的綿柔來(lái)打造北派的凈雅。二是保護(hù)遺產(chǎn)與資源，充分利用歷史文化和自然資源，天人合一、水土共釀，讓遼闊、粗獷和四季融入酒體，突出地域特色。三是科技賦能，摸清底數(shù)，采用新技術(shù)提質(zhì)增香降耗，傳承提升老工藝，創(chuàng)新釀酒新技藝，讓小眾酒走向大市場(chǎng)。