綠膿桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展

孫瑋瑋

（天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津300072）

綠膿桿菌又稱(chēng)銅綠假單胞菌，是一種條件致病性革蘭氏陰性菌，在自然界中分布廣泛，存在于土壤，水，空氣，人類(lèi)以及各種動(dòng)植物體內(nèi)等。其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多且往往表現(xiàn)出良好的生物活性，如對(duì)植物病原菌有抑制作用的吩嗪-1-羧酸，具有抗菌活性和群體感應(yīng)能力的喹諾酮類(lèi)化合物,能夠幫助細(xì)菌吸收環(huán)境中Fe3+的鐵載體，以及可作為表面活性劑的鼠李糖脂等化合物，引起了人們的廣泛關(guān)注。本文綜述了綠膿桿菌的形態(tài)特征，近些年來(lái)次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、生物活性及其在生物防治、環(huán)境治理等方面的應(yīng)用，以期為綠膿桿菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供有效的參考價(jià)值。

1 形態(tài)學(xué)特征

綠膿桿菌是假單胞菌屬的一種革蘭式陰性菌，桿狀，長(zhǎng)約 1～5μm，寬 0.5～1.0μm。單在，成對(duì)或偶爾成短鏈。菌體有鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑。無(wú)芽胞，能形成莢膜，易被普通染料著染。生長(zhǎng)溫度為25～37℃，37℃為其最適宜溫度，它在42℃下也能生長(zhǎng)，幫助它區(qū)別于許多其他的假單胞菌物種。該細(xì)菌在普通培養(yǎng)基上易于生長(zhǎng)，菌落呈圓形，光滑，微隆起，能產(chǎn)生綠膿素（藍(lán)綠色）和熒光素（黃綠色），使得培養(yǎng)基帶有藍(lán)綠色熒光[1,2]。

2 綠膿桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的分類(lèi)

2.1 吩嗪類(lèi)化合物（phenazines）

吩嗪是由綠膿桿菌分泌的一類(lèi)通常具有特殊顏色的含氮三元雜環(huán)化合物。常見(jiàn)的由其產(chǎn)生的吩嗪類(lèi)抗生素有綠膿菌素，吩嗪-1-羧酸,和吩嗪-1-甲酰胺。其中，人們對(duì)于綠膿菌素的研究最多。綠膿菌素（pyocyanin）是一種重要的細(xì)菌毒力因子，具有氧化還原能力，能接受或者貢獻(xiàn)電子，幫助細(xì)菌在缺氧環(huán)境下生存，還可破壞宿主細(xì)胞的氧化還原平衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)綠膿桿菌的基因表達(dá)[3]。而由其產(chǎn)生的吩嗪-1-羧酸則表現(xiàn)出了高效廣譜的抗菌活性。Zhou等人從一株水稻根際來(lái)源的綠膿桿菌PA1201中分離得到吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-甲酰胺，其能有效抑制水稻紋枯病菌和水稻白葉枯病菌的生長(zhǎng)[4]。這些吩嗪類(lèi)化合物的生物合成途徑也被廣泛研究，由分支酸（chorismic acid）開(kāi)始，經(jīng)過(guò)一系列蛋白PhzA-G的作用轉(zhuǎn)換成吩嗪-1-羧酸，隨后，經(jīng)過(guò)各種酶的作用PhzH，PhzS和PhzM等，生成一系列不同的吩嗪類(lèi)化合物[5]。

2.2 喹諾酮類(lèi)化合物（quinolones）

綠膿桿菌能產(chǎn)生50多種喹諾酮類(lèi)化合物，這一系列化合物的基本骨架為2位烷烴或烯烴鏈取代的4-喹諾酮或其N(xiāo)-羥基衍生物。這些化合物的結(jié)構(gòu)有時(shí)候也以互變異構(gòu)形式表示，稱(chēng)為4-羥基-2-烷基喹啉及其N(xiāo)-氧化物衍生物[5,6]。其中一些喹諾酮N-羥基衍生物往往表現(xiàn)出了良好的抗菌活性，如2-庚基-1-羥基4-喹諾酮被報(bào)到對(duì)金黃色葡萄球菌有適度的抑制作用，并且還能夠通過(guò)抑制細(xì)胞色素b，阻斷電子傳遞鏈，在瓊脂板上選擇代謝受損的小菌落變體[7]。除抗菌活性之外，2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮（PQS）和 2-庚基-4-喹諾酮（HHQ）還是十分重要的群體感應(yīng)信號(hào)分子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞毒力因子的表達(dá)，影響細(xì)菌物質(zhì)運(yùn)輸，在壓力條件下還能夠平衡細(xì)菌濃度。在生物合成途徑上，這一系列的喹諾酮類(lèi)化合物在多種基因調(diào)控下，由鄰氨基苯甲酸和酮基脂肪酸縮合而成[8]。到如今，仍然有新的喹諾酮（喹啉）類(lèi)化合物被不斷從綠膿桿菌中分離出來(lái)，如Supong等人在2016年從水稻根部組織分離的一株綠膿桿菌BCC76810中得到了12個(gè)喹琳類(lèi)化合物，包括4個(gè)在之前未被報(bào)道過(guò)的新化合物。這些化合物展現(xiàn)出了良好的抗菌，抗癌，抗瘧疾以及抗氧化活性[9]。

2.3 鐵載體（siderpores）

鐵是生命的一種必須元素，它參與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)，微生物也需要其合成生命活動(dòng)所需要的細(xì)胞色素和酶等。但是大多數(shù)情況下，鐵是以三價(jià)的形式存在，很難吸收利用。而綠膿桿菌能夠分泌兩種重要的鐵載體叫做綠膿桿菌螯鐵蛋白（Pyochelin）和銅綠假單胞菌鐵載體（Pyoverdine），它們與鐵離子有較高的絡(luò)合能力，將環(huán)境中的鐵離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，再還原成二價(jià)鐵以滿(mǎn)足細(xì)菌生命活動(dòng)的需要。在結(jié)構(gòu)上，綠膿桿菌螯鐵蛋白Pyochelin是一分子水楊酸和兩分子的半胱氨酸的縮合產(chǎn)物[10]。銅綠假單胞菌鐵載體Pyoverdine由3部分組成：一種熒光二羥基喹啉顯色團(tuán)，與顯色團(tuán)的氨基結(jié)合的?；鶄?cè)鏈(二羧酸或酰胺)，一種可變肽鏈通常由一個(gè)酰胺基連接到色團(tuán)的C1（很少是C3）羧基上[11]。

2.4 藤黃綠膿菌素（Pyoluteorin）

藤黃綠膿菌素（Pyoluteorin），是由綠膿桿菌產(chǎn)生的一種聚酮類(lèi)代謝物，最早是由Takeda在1958年從銅綠假單胞菌即綠膿桿菌T359和IFO3455分離得到的，結(jié)構(gòu)上是由一個(gè)間苯二酚和一個(gè)二氯吡咯通過(guò)一個(gè)人羰基連接而成，能抑制多種細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，尤其對(duì)植物病原菌的抑制效果顯著，對(duì)卵菌屬真菌抑制性最強(qiáng)。終極腐霉可使許多寄主植物的幼苗枯萎和根基腐爛。Plt可抑制由終極腐霉引起的枯萎衰退[12]。

2.5 鼠李糖脂（rhamnolipids）

鼠李糖脂（rhamnolipids）是綠膿桿菌產(chǎn)生的一種可作為生物表面活性劑的次級(jí)代謝物,可用于各種環(huán)境污染修復(fù)，如烴污染，重金屬污染和藻類(lèi)污染，同時(shí)還有抑制植物病原菌，抗腫瘤等生物活性。它主要由兩部分組成，分別為親水基團(tuán)的鼠李糖和疏水基團(tuán)的不飽和脂肪酸[13]。Zhang等人從大慶油田油水采出液中篩選出一株產(chǎn)表面活性劑的綠膿桿菌QS-M2，其代謝產(chǎn)物經(jīng)薄層層析和 HPLC-MS鑒定表明:主要的表面活性劑物質(zhì)是鼠李糖脂類(lèi)物質(zhì)，其中單鼠李糖脂的主要組分為RhaC10C10、RhaC12C12，雙糖脂的主要組分為 Rha2C14C12、Rha2C10C12和Rha2C10C10[14]。

2.6 其它

綠膿桿菌還能產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）和氫氰酸（HCN）類(lèi)物質(zhì)，Bano等人從土壤中分離出一株綠膿桿菌NJ-15,對(duì)植物病原菌尖孢鐮刀菌，煙草赤星病菌，苗木莖腐病菌有較好的抑制作用。該菌株在含有色氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生大量的吲哚乙酸，用chrome azurol S和King's B培養(yǎng)基培養(yǎng)能同時(shí)產(chǎn)生氫氰酸和鐵蛋白。吲哚乙酸能促進(jìn)植株的生長(zhǎng)，而氫氰酸則能病原菌細(xì)胞色素c氧化酶的活性，阻斷呼吸電子傳遞鏈，有助于抑制各種植物病原菌[15]。

N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）也是一類(lèi)能夠調(diào)節(jié)群體行為的生物信號(hào)分子。結(jié)構(gòu)上，它們是由不同長(zhǎng)度和取代位置的脂肪酸通過(guò)肽鍵連接到高絲酸內(nèi)酯上。綠膿桿菌能分泌兩類(lèi)AHLs,分別為N-3-oxo-dodecanoyl homoserine lactone（3-oxoC12-HSL）和 N-butanoyl homoserine lactone（C4-HSL）。一些含量較低的其他AHLs也可從綠膿桿菌的上清液中檢測(cè)到，如3-oxo-C14-HSL and 3-oxo-C10-HSL[16]。

綠膿桿菌可產(chǎn)生多種酶類(lèi)化合物，如Ren等人發(fā)現(xiàn)一株土壤來(lái)源的綠膿桿菌CS-2能分泌一種有機(jī)溶劑耐受性胞外脂肪酶，這些酶可催化水解一些水不溶性酯類(lèi)化合物，是工業(yè)酶制劑研究的重要組成部分[17]。Gupta等人發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌GRC1能分泌一種胞外幾丁質(zhì)酶，能抑制引起花生莖葉病的核盤(pán)菌，可開(kāi)發(fā)為生物控制劑，用來(lái)防治植物病害[18]。Nagafi等人從綠膿桿菌PD100中分離得到了一種蛋白質(zhì)酶，該酶可在溶劑存在下降解蛋白，其在廢物處理應(yīng)用，洗滌劑和皮革工業(yè)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[19]。

綠膿桿菌還能產(chǎn)生另外一類(lèi)毒力因子叫做外源凝集素（lectins）。Imbetry等人報(bào)道了兩類(lèi)由綠膿桿菌產(chǎn)生的外源性凝集素PAIL和PAIIL。它們作為疫苗使用，注射到小鼠體內(nèi)后，可充分提供保護(hù)使其免受綠膿桿菌的感染。這些凝集素的另一個(gè)有前途的用途是，它們可用于篩選聚糖，這些聚糖可能與病原體對(duì)宿主細(xì)胞的粘附有效競(jìng)爭(zhēng)，從而有助于調(diào)解微生物對(duì)抗生素耐藥性增加的問(wèn)題。且研究表明，PA-IL和PA-IIL都是具有這種潛力的天然聚糖的非常有用的探針[20]。

3 應(yīng)用前景研究

3.1 生物防治植物病害

綠膿桿菌所產(chǎn)生的物質(zhì)活性多樣，應(yīng)用前景十分廣闊，尤其在生物防治農(nóng)業(yè)病害方面。Shi等人從番木瓜果皮內(nèi)篩選出一株銅綠假單胞菌MGP3，該菌株對(duì)10種病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用，尤其對(duì)炭疽病和疫霉病有良好的治療效果，具有潛在的生防應(yīng)用價(jià)值[21]。Yang等人從受感染的玉米葉中分離出一株綠膿桿菌CB-4，具有高效的除草活性，對(duì)Digitariasanguinalis展示了十分強(qiáng)大的抑制作用，其刺激代謝物可進(jìn)一步用于開(kāi)發(fā)為生物除草劑[22]。Ren等人才從一株水稻上分離出綠膿桿菌ZJ1999,其對(duì)水稻紋枯病具有較強(qiáng)拮抗作用[23]。

3.2 治理污染

銅綠假單胞菌和許多其他假單胞菌一樣可以降解芳香烴，如甲基苯，一種被認(rèn)為是存在于大氣、地下和土壤以及地表水中的環(huán)境污染物。銅綠假單胞菌通過(guò)將甲基氧化為醛、醇和酸來(lái)降解甲苯，然后將其轉(zhuǎn)化為兒茶酚[24]。因此，銅綠假單胞菌可用于污染控制。Huang等人從礦井周?chē)缬臀廴就翗又泻Y得兩株綠膿桿菌，分別命名為綠膿桿菌WB2以及SA1，通過(guò)搖瓶降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩株菌具有協(xié)同降油能力，對(duì)石油污染土壤具有修復(fù)作用[25]。另一株銅綠假單胞菌NY3的胞外分泌物對(duì)烴類(lèi)具有降解作用，可用于治理烴類(lèi)污染，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其胞外小分子活性物主要是吩嗪類(lèi)和異咯嗪類(lèi)化合物，這些小分子活性物具有氧化還原反應(yīng)活性，可以加快電子傳遞速度，從而促進(jìn)NY3菌代謝烴的效率[26]。

4 結(jié)論與展望

綠膿桿菌是一種臨床上較為常見(jiàn)的致病菌，但其產(chǎn)生的次級(jí)代謝物結(jié)構(gòu)多樣，生物活性豐富，在植物病害防治，治理污染以及用作表面活性劑方面等都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，由于微生物發(fā)酵獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物含量較低，而通過(guò)生物合成和化學(xué)合成次級(jí)產(chǎn)物難度較大，很多技術(shù)還不成熟，這成為日后需要解決的一個(gè)問(wèn)題。隨著近年來(lái)生物合成，基因組學(xué)，分離技術(shù)和儀器的不斷發(fā)展，相信在不久的將來(lái)，微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物一定會(huì)得到更好地利用。