馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚的耳毒性及腎毒性研究*

諶晶晶 唐旭霞 徐慧芳 石涯

馬兜鈴酸(aristolochic acid, AA)為硝基菲類有機(jī)酸，其具有廣泛的藥理作用，如：抗癌、抗感染、增強(qiáng)細(xì)胞免疫。含馬兜鈴酸的中草藥達(dá)數(shù)十余種，如：關(guān)木通、天仙藤、廣防己、青木香、細(xì)辛等，目前，收載于中國(guó)藥典、部頒標(biāo)準(zhǔn)以及地方藥材標(biāo)準(zhǔn)的馬兜鈴科中藥材有24種、含馬兜鈴屬中藥材的中成藥口服制劑有47種[1]。但是，馬兜鈴酸具有明確的腎毒性，并且，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸可能是誘發(fā)肝癌的重要因素[2]，因此，很多國(guó)家對(duì)含馬兜鈴酸藥物的使用都有嚴(yán)格的規(guī)定。我國(guó)藥物監(jiān)督行政部門對(duì)含馬兜鈴酸的中藥材也實(shí)施了嚴(yán)格管制[3]。很多具有腎毒性的藥物，同時(shí)也有耳毒性，如：氨基糖苷類抗生素、順鉑類抗腫瘤藥物、中草藥雷公藤[4]等。馬兜鈴酸具有明確的腎毒性，但其有無(wú)耳毒性未見臨床報(bào)道，也尚無(wú)該方面的研究。斑馬魚具有與哺乳動(dòng)物相似的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，身體透明，繁殖周期短，這些特征使斑馬魚成為高通量進(jìn)行藥物耳毒性及聽細(xì)胞保護(hù)劑研究的理想模型。故本研究利用斑馬魚來(lái)觀察馬兜鈴酸的腎毒性，并對(duì)馬兜鈴酸的耳毒性進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對(duì)交配的方式進(jìn)行。每次交配準(zhǔn)備4～5對(duì)成年斑馬魚，平均每對(duì)能產(chǎn)200～300個(gè)胚胎。在受精后6小時(shí)(即6 hpf)和24 hpf對(duì)胚胎進(jìn)行清理(移除已死亡胚胎)，并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。在28 ℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎(養(yǎng)魚用水水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μs/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)。以受精后5天(5 dpf)的斑馬魚為研究對(duì)象[因?yàn)榕咛タ梢詮淖陨淼穆腰S囊中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在受精后9天內(nèi)(9 dpf)不需要喂食]。

1.2實(shí)驗(yàn)用藥、儀器與試劑 馬兜鈴酸(阿拉丁，批號(hào)67451)：用1.0%的二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為6.8 mg/ml的儲(chǔ)備液，-20 ℃保存；慶大霉素(阿拉丁，批號(hào)39970)用超純水配制成25 mg/ml的儲(chǔ)備液，-20 ℃保存)，熒光立體顯微鏡(Nikon AZ 100, Japan)；6孔板(Nest Biotech)；二甲基亞砜(DMSO，阿拉丁，批號(hào)1095515)； DASPEI染料(sigma，批號(hào)109k1336)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1確定馬兜鈴酸的最大非致死濃度(maximum non-lethal concentration，MNLC) 馬兜鈴酸的初始檢測(cè)濃度設(shè)計(jì)為6.8、3.4、1.7、0.85、0.425 μg/ml。分別用上述不同濃度的馬兜鈴酸處理15尾5 dpf的斑馬魚，24 h后，統(tǒng)計(jì)不同濃度下斑馬魚的死亡數(shù)量，使用Graphpad prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件繪制最佳的濃度效應(yīng)曲線，計(jì)算出馬兜鈴酸的MNLC。

1.3.2評(píng)價(jià)馬兜鈴酸的毛細(xì)胞毒性 根據(jù)MNLC，選取4個(gè)濃度(MNLC、1/2 MNLC、1/4 MNLC、1/8MNLC)的馬兜鈴酸，每個(gè)濃度處理30尾5 dpf的斑馬魚，分別命名為MNLC組、1/2 MNLC組、1/4 MNLC組、1/8MNLC組，所有實(shí)驗(yàn)組均含有相同濃度的溶劑。陽(yáng)性對(duì)照組(慶大霉素組)：用2.5 μg/ml的慶大霉素飼養(yǎng)30尾5 dpf斑馬魚；陰性對(duì)照組(溶劑組)：用1.0%DMSO飼養(yǎng)30尾5 dpf斑馬魚 。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚的毛細(xì)胞損傷率計(jì)算公式如下：

×100%

根據(jù)毛細(xì)胞損傷率繪制劑量效應(yīng)曲線；采用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1馬兜鈴酸的MNLC 不同濃度馬兜鈴酸組斑馬魚的死亡率見表1。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，用GraphPad 6.0擬合濃度致死曲線，未能得到MNLC擬合結(jié)果，故本研究取未出現(xiàn)斑馬魚死亡的最大濃度(3.4 μg/ml)為MNLC。

2.2馬兜鈴酸的毛細(xì)胞毒性 活體斑馬魚染色后，毛細(xì)胞與染料結(jié)合后，發(fā)綠色熒光；可見，斑馬魚的毛細(xì)胞分布在側(cè)線神經(jīng)丘及頭部，如圖1中紅色標(biāo)記所示。拍照后，用圖像處理軟件分析圖1中各組斑馬魚紅色部分毛細(xì)胞熒光強(qiáng)度，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：慶大霉素組(陽(yáng)性對(duì)照組)毛細(xì)胞損傷率為88.5%，與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。馬兜鈴酸0.425、0.85、1.7、3.4 μg/ml各組(即1/8MNLC、1/4MNLC、1/2MNLC及MNLC組)毛細(xì)胞損傷率分別為12.4%、-0.4%、6.9%、-7.2%，與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 不同濃度馬兜鈴酸誘發(fā)的斑馬魚死亡率(n=15)

表2 各組相對(duì)熒光強(qiáng)度及毛細(xì)胞的損傷率

注：與陰性對(duì)照組比較， *:P<0.01

2.3馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚的腎毒性 各組剩余20尾斑馬魚飼養(yǎng)72 h后，馬兜鈴酸0.425、0.85 μg/ml組斑馬魚均無(wú)死亡，1.7 μg/ml組死亡率為10%，3.4 μg/ml組全部死亡。馬兜鈴酸1.7 μg/ml組中觀察到11.1%的斑馬魚出現(xiàn)嚴(yán)重的腎包膜水腫(圖2)。陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及馬兜鈴酸0.425、0.85 μg/ml組均未觀察到明顯的腎包膜水腫現(xiàn)象。

3 討論

斑馬魚屬于低等脊椎動(dòng)物，其生長(zhǎng)周期短，產(chǎn)卵量大，胚胎體外發(fā)育且透明。斑馬魚雖然沒有外耳和中耳，但有典型的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)，同時(shí)，其身體側(cè)線上用來(lái)感知周圍水流方向和變化的毛細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上也與哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞非常相似[5,6]。利用其胚胎透明的特點(diǎn)，可以在顯微鏡下直接觀察給藥前后內(nèi)耳形態(tài)的變化和身體側(cè)線上的毛細(xì)胞，便于進(jìn)行活體染色和觀察。2005年，Ton等[7]首次用斑馬魚模型來(lái)評(píng)估藥物耳毒性；2008年，Chiu等[6]使用斑馬魚模型篩查了FDA批準(zhǔn)使用的1 040種藥物，發(fā)現(xiàn)21種藥物具有斑馬魚耳毒性，其中2種藥物的耳毒性作用進(jìn)一步在大鼠實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)[6]，證明了斑馬魚在研究藥物耳毒性方面的價(jià)值。

3.1馬兜鈴酸的腎毒性 本研究所用馬兜鈴酸濃度雖然未能得出其最大非致死濃度，但在6.8 μg/ml的濃度下處理24 h，斑馬魚均死亡，明確了馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚的毒性作用。本研究觀察到馬兜鈴酸1.7 μg/ml組中11%的斑馬魚出現(xiàn)了嚴(yán)重的腎包膜水腫，推測(cè)其死亡可能是因嚴(yán)重的腎毒性造成。Ding等[8]用馬兜鈴酸處理發(fā)育早期的斑馬魚，發(fā)現(xiàn)斑馬魚水腫以及腎臟形態(tài)功能異常，并最終導(dǎo)致斑馬魚死亡。腎臟是脊椎動(dòng)物最主要的排泄器官，馬兜鈴酸是大分子物質(zhì)，與血漿白蛋白結(jié)合后不能經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)，其部分代謝產(chǎn)物主要經(jīng)由腎小管分泌、排泄，這一過(guò)程主要依賴于近端腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，因此，馬兜鈴酸誘發(fā)的腎損傷主要發(fā)生在近端腎小管[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激、DNA損傷、免疫炎癥機(jī)制、凋亡機(jī)制等都與馬兜鈴酸引起的腎臟損傷有關(guān)[1]。

3.2馬兜鈴酸的耳毒性 耳蝸中階外側(cè)壁上血管紋的血-迷路屏障能在一定程度上保護(hù)內(nèi)耳不接觸來(lái)自血液中的有害物質(zhì)。有研究顯示耳毒性藥物可能是通過(guò)血-迷路屏障從血液進(jìn)入到內(nèi)耳的液體循環(huán)[9]。目前并無(wú)馬兜鈴酸導(dǎo)致聽力損傷的臨床病例報(bào)道，推測(cè)馬兜鈴酸可能因分子較大而無(wú)法通過(guò)人體的血-迷路屏障。但斑馬魚身體側(cè)線毛細(xì)胞無(wú)該屏障的保護(hù)作用，并且實(shí)驗(yàn)中馬兜鈴酸的給藥方式是直接稀釋到溶劑DMSO中來(lái)飼養(yǎng)斑馬魚，馬兜鈴酸可以通過(guò)斑馬魚腸道和皮膚吸收進(jìn)入體內(nèi)，盡管如此，馬兜鈴酸仍然未對(duì)斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞造成損傷。推測(cè)可能與馬兜鈴酸的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)：馬兜鈴酸是硝基菲類有機(jī)酸，馬兜鈴酸及其衍生物的生理活性和毒性作用與分子結(jié)構(gòu)中的羥基、甲氧基和硝基的位置和數(shù)量相關(guān)[10]，分子結(jié)構(gòu)的差異可能是馬兜鈴酸無(wú)耳毒性的原因。本實(shí)驗(yàn)中未觀察到馬兜鈴酸的耳毒性，基于斑馬魚的給藥方式及其缺乏血-迷路屏障的保護(hù)作用，有理由認(rèn)為到達(dá)斑馬魚毛細(xì)胞的藥物濃度高于到達(dá)人內(nèi)耳的藥物濃度，因此推測(cè)不導(dǎo)致斑馬魚死亡的藥物濃度對(duì)人內(nèi)耳是相對(duì)安全的。但在血-迷路屏障受到損害，如內(nèi)耳缺血缺氧，或者藥物濃度進(jìn)一步增加的情況下，是否會(huì)造成人內(nèi)耳損傷，尚不能給出結(jié)論。而更高濃度的馬兜鈴酸會(huì)導(dǎo)致斑馬魚死亡，因而也無(wú)法通過(guò)斑馬魚模型來(lái)進(jìn)一步研究馬兜鈴酸對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞的毒性作用。

本研究的不足之處在于：①馬兜鈴酸濃度的選擇欠佳，無(wú)法通過(guò)所選藥物濃度判斷馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚的毒性作用是否存在劑量依賴關(guān)系；②僅依靠免疫熒光強(qiáng)度來(lái)判斷馬兜鈴酸是否存在耳毒性，而未觀察毛細(xì)胞的形態(tài)是否有輕微異常改變。在今后的實(shí)驗(yàn)中，將再設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)藥物濃度，進(jìn)一步通過(guò)透射電鏡觀察斑馬魚毛細(xì)胞的形態(tài)，甚至斑馬魚的行為改變，以期更全面地認(rèn)識(shí)馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚毛細(xì)胞的影響。

圖1 馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚毛細(xì)胞影響的熒光染色結(jié)果(紅色部分的綠色熒光為毛細(xì)胞)

圖2 馬兜鈴酸對(duì)斑馬魚腎包膜影響的染色結(jié)果(紅色部分為水腫的腎包膜)