慢性乙肝患者血清Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平表達(dá)與病情程度相關(guān)性研究

劉宗萍（陜西省寶雞市口腔醫(yī)院檢驗(yàn)科 陜西寶雞 721000）

近年來(lái)，慢性乙肝患者患病率呈逐年上升趨勢(shì)，由于疾病初期無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，故診斷困難，所以血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)在慢性乙肝患者疾病中的診療價(jià)值得到普遍關(guān)注[1-2]。為了研究血清學(xué)指標(biāo)在慢性乙肝患者中的表達(dá)情況，本課題首先對(duì)所選取研究對(duì)象轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1），T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）和乙肝表面抗原（HBsAg）表達(dá)進(jìn)行分析，進(jìn)一步對(duì)上述指標(biāo)在慢性乙肝患者與正?；颊咧械谋磉_(dá)水平及慢性乙肝患者與血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行Logistic分析，同時(shí)對(duì)上述指標(biāo)與研究對(duì)象肝功能指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，初步研究TGF-β1，Tim-3和HBsAg單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)慢性乙肝患者檢測(cè)的能效分析。通過(guò)本次研究旨在對(duì)慢性乙肝患者相關(guān)血清水平檢測(cè)進(jìn)行進(jìn)一步的探討。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前臨床并未發(fā)現(xiàn)關(guān)于上述指標(biāo)與慢性乙肝病情評(píng)估中綜合應(yīng)用價(jià)值的系統(tǒng)性研究，基于此，本研究通過(guò)比較慢性乙肝患者和健康人群Tim-3，HBsAg和TGF-β1水平，探討Tim-3，HBsAg和TGF-β1與疾病病情程度間的關(guān)聯(lián)性及診斷價(jià)值，以期為疾病臨床診斷提供新的思路及途徑。報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2017年10月～2019年6月收治的慢性乙肝患者103例作為研究組，另選取同期健康體檢者103例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：研究組符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中慢性乙肝診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；年齡＜60歲；知曉本研究，簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)肝癌、肝內(nèi)巨大血管瘤、肝內(nèi)膽管結(jié)石；藥物性肝損傷；哺乳期及妊娠期女性 ；并發(fā)免疫功能異常；并發(fā)全身性感染性病變、血液系統(tǒng)及代謝系統(tǒng)病變；納入研究前3個(gè)月內(nèi)采取抗病毒及免疫調(diào)節(jié)治療。研究組男性56例，女性47例；年齡39～58歲，平均年齡48.06±4.91歲；病情程度：輕度28例，中度43例，重度32例。對(duì)照組男性59例，女性44例；年齡36～59歲，平均年齡47.89±5.10歲。兩組性別、年齡等基線資料均衡可比（P＞0.05），且本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 試劑和儀器 美國(guó)Bio-RAD公司Bio-RAD550型酶標(biāo)儀，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司酶聯(lián)免疫試劑，美國(guó)雅培公司Abbott Architect I2000型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)與配套試劑。

1.3 方法 兩組均于入院后第2天空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5 ml，3 000 r/min，離心10 min，取上清液，置于-20℃環(huán)境中儲(chǔ)存待檢，以酶標(biāo)儀經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定肝功能指標(biāo)（CG，ALT，AST，DBIL和TBIL）水平、TGF-β1水平；采取全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫系統(tǒng)與配套試劑，經(jīng)化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法測(cè)定HBsAg表達(dá)情況；取新鮮肝素鋰抗凝外周全血100μl，置于流式管內(nèi)，加入PE-Tim-3，F(xiàn)ITCCD8，APC-CD3熒光單克隆抗體，于4℃環(huán)境中避光孵育30 min，加入溶血素1 ml于室溫下避光10 min，待其成真性溶液，離心處理，經(jīng)PBS洗滌2次，以PBS 300μl重懸處理，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定Tim-3表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理使用SPSS 24.0軟件包，肝功能指標(biāo)及TGF-β1，Tim-3及HBsAg以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，t檢驗(yàn)。敏感度、特異度、準(zhǔn)確度以n（%）表示，χ2檢驗(yàn)。慢性乙肝發(fā)病影響因素采用Logistic回歸分析，血清各指標(biāo)水平與慢性乙肝肝功能的關(guān)聯(lián)性采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。通過(guò)對(duì)兩組患者肝功能指標(biāo)進(jìn)行比較，研究組患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.412～53.782，均P＜0.05）。

表1 兩組患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水平比較（±s）

表1 兩組患者血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水平比較（±s）

項(xiàng) 目 研究組（n=103） 對(duì)照組（n=103） t P CG（mg/L） 30.53±6.44 1.89±0.51 44.993 ＜0.001 ALT（U/L） 245.33±40.81 27.41±5.06 53.782 ＜0.001 AST（U/L） 160.27±25.76 31.29±4.41 50.087 ＜0.001 DBIL（μmol/L） 6.56±1.10 2.44±0.68 32.333 ＜0.001 TBIL（μmol/L） 22.69±5.91 8.28±0.98 24.412 ＜0.001

2.2 TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比較 見(jiàn)表2。研究組TGF-β1，Tim-3和HBsAg水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.878～37.574，均P＜0.05）。

表2 兩組患者TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比較（±s）

表2 兩組患者TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平比較（±s）

項(xiàng) 目 研究組（n=103） 對(duì)照組（n=103） t P TGF-β1（pg/ml） 71.13±10.18 28.79±6.44 35.672 ＜0.001 Tim-3（%） 24.44±6.06 4.70±2.87 29.878 ＜0.001 HBsAg（ng/ml） 3.83±1.01 0.09±0.02 37.574 ＜0.001

2.3 慢性乙肝發(fā)病影響因素的多元回歸分析 見(jiàn)表3。以慢性乙肝發(fā)病作因變量，將性別、年齡、TGF-β1，Tim-3及HBsAg水平作自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示患者乙肝發(fā)病與性別（OR=1.527），年齡（OR=1.959）均屬于獨(dú)立危險(xiǎn) 因 素(χ2=0.145～0.238，P＞0.05),而 患 者HBsAg（OR=2.234），Tim-3（OR=2.634） 及TGF-β1（OR=2.768）均為影響慢性乙肝發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（χ2=5.862～11.140，均P＜0.05）。

表3 慢性乙肝患者發(fā)病影響因素Logistic分析

2.4 TGF-β1，Tim-3，HBsAg與肝功能指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析 見(jiàn)表4。通過(guò)對(duì)TGF-β1，Tim-3及HBsAg與CG，ALT，AST，DBIL，TBIL進(jìn)行相關(guān)性分析，TGF-β1，Tim-3及HBsAg與ALT，AST，DBIL，TBIL均存在顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.698～0.822,均P＜0.05）。

表4 TGF-β1，Tim-3及HBsAg與肝功能指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析

2.5 TGF-β1，Tim-3和HBsAg單獨(dú)及聯(lián)合診斷效能 見(jiàn)表5。TGF-β1，Tim-3和HBsAg的 敏感度、特異度、準(zhǔn)確度在單獨(dú)診斷時(shí)結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.241，2.145，P ＞0.05），聯(lián)合診斷時(shí)敏感度、特異度、準(zhǔn)確度均高于單獨(dú)診斷，聯(lián)合診斷與單獨(dú)診斷結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.662～22.685，均P＜0.05）。

表5 TGF-β1，Tim-3，HBsAg及聯(lián)合診斷效能對(duì)比[%（n）]

3 討論

由于在慢性乙肝發(fā)病機(jī)制中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可促使機(jī)體免疫系統(tǒng)活化，生成大量細(xì)胞因子，而宿主免疫功能狀態(tài)在疾病發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用，可通過(guò)免疫應(yīng)答對(duì)宿主自身細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)[8-10]。因此相關(guān)因子檢測(cè)對(duì)慢性乙肝檢測(cè)成為一個(gè)研究重點(diǎn)，Tim-3為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)負(fù)性免疫調(diào)控因子，在腫瘤、自身免疫性病變、感染性疾病發(fā)生中均具有重要作用[11]。Tim-3通過(guò)和配體半乳糖凝集素-9（Galectin-9）結(jié)合后于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)活化過(guò)程中增加Tim-3蛋白表達(dá)水平，Tim-3水平增加可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡并抑制Th1型免疫反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)慢性乙肝患者Th1/Th2平衡[12-13]。而Th1/Th2平衡與慢性乙肝患者病情程度的關(guān)聯(lián)性具有重要意義[14]。張華琳等[15]研究表明，慢性乙肝患者Tim-3蛋白表達(dá)水平可以作為慢性HBV感染者病情變化的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。這與本次研究Tim-3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果一致。而劉霞[16]研究指出，慢性乙肝患者外周血Tim-3表達(dá)水平顯著高于健康組，且重度患者Tim-3表達(dá)水平較輕度患者更高。這與本研究研究組Tim-3水平高于對(duì)照組結(jié)果一致，這也提示Tim-3參與了慢性乙肝發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程。

TGF-β1可代表Treg特性及功能，在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中具有重要作用，其高表達(dá)狀態(tài)可影響機(jī)體內(nèi)HBV病毒的清除。臨床研究表明，TGF-β1為肝纖維化關(guān)鍵介導(dǎo)因子，其可增加膠原基因表達(dá)、促使成纖維細(xì)胞生成，造成細(xì)胞外基質(zhì)異常合成及堆積[17]。同時(shí)，學(xué)者黃國(guó)棟等[18]指出，TGF-β1水平在慢性乙肝早期即可異常增高，有望成為疾病早期診斷指標(biāo)。DENG等[19]認(rèn)為，TGF-β1可促使肝細(xì)胞損傷壞死、凋亡，其能作用于肝星狀細(xì)胞，促使其轉(zhuǎn)化為肝纖維母細(xì)胞，并合成大量膠原，加速肝纖維化進(jìn)程。徐愛(ài)靜等[20]研究結(jié)果表明，慢性乙肝患者TGF-β1表達(dá)水平明顯增高，且和免疫失衡狀態(tài)、肝纖維化具有密切關(guān)聯(lián)性。操偉慶等[21]研究顯示，慢性乙肝患者血清TGF-β1含量較正常水平明顯增高，其參與了肝臟損傷及病情進(jìn)展。本研究也表明，研究組TGF-β1水平高于對(duì)照組，與上述結(jié)果具有一致性，表明TGF-β1在疾病發(fā)生及進(jìn)展中具有重要作用。此外，HBsAg為慢性乙肝治療效果的重要評(píng)估指征，其定量監(jiān)測(cè)結(jié)果和慢性乙肝患者肝細(xì)胞核中HBV DNA含量關(guān)系密切，能反映肝臟中共價(jià)閉合環(huán)狀DNA表達(dá)情況[22]。同時(shí)，HBsAg還可直接反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)[23]。但既往多是分析HBsAg在慢性乙肝治療效果評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，徐少華等[24]學(xué)者證實(shí)，HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者血清定量值可以作為慢性乙型肝炎血清學(xué)轉(zhuǎn)換且不會(huì)因?yàn)檩斞纫蛩囟M(jìn)行變化，是一種較穩(wěn)定的檢測(cè)標(biāo)志物，提示我們HBsAg血清表達(dá)作為診斷慢性乙肝的輔助指標(biāo)之一，具有高穩(wěn)定性。

在臨床檢測(cè)中，CG，ALT，AST，DBIL和TBIL均為臨床評(píng)估肝臟功能的指標(biāo)，若肝臟發(fā)生壞死或變性等損傷，則此類(lèi)指標(biāo)水平可出現(xiàn)明顯異常。而本研究中，我們通過(guò)檢測(cè)血清CG，ALT，AST，DBIL和TBIL水 平 與Tim-3，HBsAg，TGF-β1進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明肝功能指標(biāo)與Tim-3，HBsAg，TGF-β1間存在顯著正相關(guān)，且上述血清指標(biāo)聯(lián)合診斷敏感度、準(zhǔn)確度等顯著高于單獨(dú)診斷。表明通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)Tim-3，HBsAg，TGF-β1表達(dá)情況，不僅能提高慢性乙肝診斷準(zhǔn)確性，最大程度降低漏診及誤診風(fēng)險(xiǎn)，且可為肝功能的準(zhǔn)確評(píng)估提供較為全面的檢測(cè)方式，以此指導(dǎo)臨床調(diào)整治療方案，保證治療有效性及針對(duì)性。綜上所述，慢性乙肝患者Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平在疾病發(fā)生及進(jìn)展中可以作為慢性乙肝進(jìn)展的檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)Tim-3，HBsAg，TGF-β1水平，可有效提升慢性乙肝診斷敏感度、準(zhǔn)確度及特異度，從而提升檢測(cè)準(zhǔn)確率。本次研究由于納入樣本量過(guò)小及不具備大型實(shí)驗(yàn)室的研究規(guī)范，此項(xiàng)研究可作為參考，以期望后期有大樣本研究，為疾病臨床診斷提供新的思路及途徑。