血管生成素樣蛋白2（ANGPTL2）對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的炎癥保護機制研究

張 恒，袁 莉，王 佩，吳曉康，雷華斌,焦飛燕

（1.北京中醫(yī)藥大學孫思邈醫(yī)院a.檢驗科；b.腦病科，陜西銅川 727031；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安 710061；3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，西安 710000；4.陜西省第四人民醫(yī)院，西安 710043）

缺血性腦血管病產(chǎn)生的神經(jīng)功能損害是醫(yī)學界一大難題[1]。研究表明，腦缺血/再灌注損傷后會引起人體血腦屏障（blood brain barrier，BBB）通透性的破壞，從而引發(fā)腦出血、腦水腫[2]。另外發(fā)現(xiàn)腦缺血后缺血區(qū)新生血管的恢復與神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長相關因子的表達水平相關[3]。血管生成素作為其中一種生長相關因子，已證實在血管新生方面具有重要作用，據(jù)報道其可改善腦血流灌注后造成的腦損傷，挽救缺血半暗帶的神經(jīng)元，從而促進腦缺血區(qū)的神經(jīng)功能恢復[4]。血管生成素樣蛋白2（Angiopoietin-Like Protein 2，ANGPTL2）作為血管生成素樣蛋白家族成員，具有促進血管發(fā)生、組織修復、維持造血干細胞的特性，調(diào)控腫瘤細胞轉移等功能，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白與糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生相關[5-7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞、巨噬細胞來源的ANGPTL2在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而血小板源的ANGPTL2在血栓形成中有關鍵作用[8]。然而，ANGPTL2在腦缺血/再灌注后腦損傷過程中的作用機制卻很少有報道。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，探討ANGPTL2對大鼠腦缺血/再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源 SPF級雄性Wister大鼠由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。選擇Wister大鼠60只，建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型，隨機分為假手術組和ANGPTL2組。

1.2 試劑與儀器 病理組織漂烘儀、包埋機購自常州市中威電子儀器有限公司；酶標儀購自美谷分子儀器有限公司；大鼠腦槽購自美國TED-Pella；氯代三苯基四氮唑溶液購自青島海博生物技術公司；ELISA試劑盒購自上海通蔚生物技術公司；PCR試劑盒購自日本TAKARA公司；SP試劑盒購自上海國源生物技術有限公司；ANGPTL2單克隆抗體購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立：參照高軒等[8]人報道的大腦中動脈線栓法建立腦缺血/再灌注模型。首先注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉大鼠，然后使大鼠仰臥位，剪開大鼠右側皮膚，暴露頸總動脈，將涂有肝素的尼龍線線栓自頸總動脈向頸內(nèi)動脈插入，栓線長度約17～18 mm，從而阻斷大腦中動脈血流，造成局灶性腦缺血。本研究分別在腦缺血30 min或90 min后松開尼龍線，造成血流再灌注。假手術組：不阻斷大鼠大腦中動脈，手術操作與模型制備相同；ANGPTL2組：再灌注同時，向大鼠尾靜脈注射ANGPTL2(2 μg/kg)。實驗過程符合動物倫理學標準。

1.3.2 ANGPTL2 mRNA及蛋白檢測：假手術組、ANGPTL2組建模6，12，24，48，72 h后，采集大鼠的外周血，進行RT-PCR檢查，應用Thermal Cycler Dice Real time System兩步法PCR擴增標準程序，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

HE染色：采用SP法，操作步驟按試劑盒說明書進行。一抗為ANGPTL2單克隆抗體。實驗結果用Image-Pro Plus高清彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)對所選取視野中陽性信號進行圖像分析。

1.3.3 大鼠神經(jīng)功能評分：建模48 h后，進行神經(jīng)功能缺損評分[9]，分為0分、1分、2分、3分、4分。在手術前1天和手術后分別進行該項檢測。

1.3.4 腦組織含水量檢測：建模48 h后，每組隨機取5只大鼠斷頭取腦，去除大鼠嗅球、小腦和腦干，測定濕重，110℃烘烤24 h后稱干重，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.5 BBB通透性檢測：建模48 h后，每組隨機取5只大鼠經(jīng)股靜脈按2 ml/kg注入2.5g/dl伊文思藍生理鹽水，2 h后經(jīng)左心室注射200 ml生理鹽水。取出腦組織將其浸潤于二甲基甲酰胺溶液，60 ℃孵育24 h，離心取上清。在620 nm波長處檢測吸光度(A)，根據(jù)標準曲線計算腦組織中伊文思藍（Evans blue, EB）含量(1 μg/g腦重量)。

1.3.6 大鼠腦梗死體積測定：建模48 h后，每組隨機取5只大鼠在規(guī)定的不同處理時間點斷頭處理，取出腦組織置于-20℃冰箱，從額極開始從前向后切取腦組織5～7片，每片約2 mm厚。然后置于2% 氯代三苯基四氮唑溶液中，37℃避光孵育30 min。紅色區(qū)域為正常腦組織，蒼白色為梗死區(qū)。采用圖像分析軟件處理計算腦梗死體積。

1.3.7 標記物檢測：分別于建模(T0)、建模后2 h(T1)，6 h(T2)，12 h(T3)和24 h(T4)各時間點抽取每組大鼠眼眶血1 ml，3000 r/min離心10 min。采用ELISA測定血清中S-100β,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1（IL-1）水平。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均值±標準差（±s）表示，采用t檢驗比較兩組間的差異。采用重復測量資料比較不同時間點大鼠血清中S-100β，TNF-α和IL-1水平。計數(shù)資料用構成比表示，采用卡方（χ2）檢驗比較組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠大腦皮層中ANGPTL2 mRNA表達水平的變化 見表1。采用免疫組化分析大鼠缺血/再灌注后大腦皮層中ANGPTL2的表達水平，缺血30和90 min時ANGPTL2mRNA的表達水平高于假手術組。大鼠腦缺血/再灌注處理后，隨著時間的延長，ANGPTL2 mRNA水平逐漸升高，在48 h時達到最高峰，隨后ANGPTL2 mRNA水平逐漸減少。

表1 缺血30 min及90 min再灌注不同時間點大腦皮層中ANGPTL2 mRNA表達的變化

表1可以看出，在缺血30min時ANGPTL2組再灌注6 h的ANGPTL2 mRNA表達水平高于假手術組(t=1.841，P=0.103)，ANGPTL2組再灌注12 h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=2.412，P=0.042)，ANGPTL2組再灌注24 h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=3.646，P=0.006)，ANGPTL2組再灌注48h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=7.437，P=0.000)，ANGPTL2組 再 灌 注72 h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=5.021，P=0.001)。在 缺 血90 min時ANGPTL2組再灌注6 h的ANGPTL2 mRNA表達水平高于假手術組(t=1.833，P=0.104)，ANGPTL2組再灌注12 h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=2.394，P=0.043)，ANGPTL2組再灌注24 h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=3.578，P=0.007)，ANGPTL2組再灌注48 h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=7.645，P=0.000)，ANGPTL2組 再 灌 注72 h的ANGPTL2 mRNA表達水平顯著高于假手術組(t=5.660，P=0.000)。

2.2 ANGPTL2對大鼠腦缺血/再灌注損傷的影響 見表2。在建模48 h后，ANGPTL2組大鼠的腦組織含水量、伊文思藍含量和腦梗死體積均顯著低于假手術組，而ANGPTL2組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著高于假手術組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表2 ANGPTL2對各指標的影響

2.3 ANGPTL2對標記物S-100β的影響 見表3。相較于T0，大鼠在T1時的S-100β顯著增加。隨著建模時間的延長，S-100β水平逐漸降低，并且與T0的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表3 ANGPTL2組不同再灌注時間對不同組大鼠血清S-100β標記物表達水平的影響

表4 ANGPLT2組不同再灌注時間對大鼠血清中TNF-α，IL-1表達水平的影響

2.4 ANGPTL2對炎癥介質(zhì)TNF-α，IL-1的影響 見表4。相較于T0，ANGTPL2組大鼠在T1，T2，T3，T4時血清TNF-α，IL-1均顯著增加，且差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

據(jù)報道血管生成素樣蛋白是與血管生成相關的一類分泌型糖蛋白，其中ANGPTL2在血管內(nèi)皮細胞受損恢復中具有重要作用，另外還發(fā)現(xiàn)ANGPTL2具有促進巨噬細胞浸潤、抑制血小板聚集的功能[8]。TAZUME等[9]發(fā)現(xiàn)了ANGPTL2在腹主動脈瘤的巨噬細胞中大量表達，證實了巨噬細胞來源的ANGPTL2能夠促進腹主動脈瘤的發(fā)展。HORIO等[10]人對10例冠心病患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞和巨噬細胞中ANGPTL2過表達，同時粥樣斑塊浸潤的巨噬細胞數(shù)目顯著降低；人為抑制內(nèi)皮源性的ANGPTL2表達后，誘導型一氧化氮合酶發(fā)生失活，內(nèi)皮細胞功能減弱，同時還促使部分促炎癥型巨噬細胞M1向抗炎癥型巨噬細胞M2的分化。然而關于ANGPTL2蛋白在腦缺血/再灌注后急性腦損傷過程中的作用機制卻少有報道。

本文發(fā)現(xiàn)在缺血30和90min時ANGPTL2組再灌注6，12，24，48和72 h的ANGPTL2 mRNA表達水平高于假手術組。在建模48 h后，ANGPTL2組大鼠的腦組織含水量、伊文思藍含量和腦梗死體積均顯著低于假手術組，ANGPTL2組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著高于假手術組。該結果表明ANGPTL2可以幫助大腦缺血/再灌注后受損傷的血腦屏障的恢復，降低腦水腫，從而遏制了腦缺血/再灌注病程的發(fā)展。

有研究報道，腦梗死體積和腦出血量與S-100β蛋白表達水平呈正相關[11]。另外發(fā)現(xiàn)腦損傷發(fā)生20 min后血清中S-100β濃度就會出現(xiàn)明顯升高[12]。且大量研究證實缺血、缺氧是誘導神經(jīng)細胞內(nèi)S-100β表達上調(diào)的重要因素，因此S-100β水平可作為檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的一個靈敏性指標[13]。本研究中將S-100β水平高低作為判斷血腦屏障是否損傷的監(jiān)測指標，S-100β蛋白分子量大，如果血腦屏障未受到損傷的情況下，正常腦血流中很難檢測到S-100β，只有當血腦屏障發(fā)生破壞時才能檢測到。本研究結果顯示相較于T0，大鼠在T1時S-100β顯著增加。隨著建模時間的延長，S-100β水平逐漸降低，并且與T0的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明ANGPTL2可有效降低S-100β蛋白的表達，對腦缺血/再灌注損傷（中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷）有保護作用。

大腦缺血/再灌注時分子氧進入缺血組織時會產(chǎn)生O2-，OH-等氧自由基，從而激活促炎癥相關的轉錄信號，導致炎性因子表達量升高，這是目前關于腦缺血/再灌注損傷時發(fā)生的機制[14]。本研究結果表明相較于T0，ANGPTL2組大鼠在T1，T2，T3，T4時血清中TNF-α和IL-1水平均顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。ANGPTL2作為一種多功能的炎性因子可以參與多種信號通路在不同的組織細胞中發(fā)揮功能[15-16]。目前發(fā)現(xiàn)ANGPTL2主要通過結合整合素α5β1和免疫抑制性受體來發(fā)揮生理作用[17]。本研究揭示了ANGPTL2可以促進組織炎癥反應、減輕由腦缺血、缺氧造成的BBB通透性的改變、降低S-100β蛋白的表達，具有幫助腦缺血/再灌注損傷恢復的作用。