右美托咪定對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷程度、炎性因子及Toll 樣受體4/核因子кB 信號(hào)通路的影響研究

任小鵬，孫春喜，李建成，高彥霞，潘龍飛

心肌缺血再灌注損傷是心肌組織和細(xì)胞缺血后血液復(fù)流引起的心肌組織損傷現(xiàn)象［1］，研究表明，多種病理生理機(jī)制參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，其中炎性反應(yīng)與心肌缺血再灌注損傷的關(guān)系是近年研究熱點(diǎn)［2］。Toll 樣受體4/核因子κB（TLR4/NF-κB）信號(hào)通路在抗炎和細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用［3］。有研究表明，缺血再灌注損傷與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)［4］。右美托咪定可通過(guò)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，但其對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在探討右美托咪定對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷程度、炎性因子、TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 心肌細(xì)胞及其培養(yǎng) 2018 年2—12 月，選取大鼠源性H9C2 心肌細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心。心肌細(xì)胞系于37 ℃、含5%二氧化碳環(huán)境下的DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和鏈霉素）中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁80%后采用胰蛋白酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞，并隨機(jī)分為對(duì)照組、心肌細(xì)胞損傷組、預(yù)處理組。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)），胰蛋白酶（Sigma 公司，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒〔生工生物工程（上海）有限公司〕，TLR4 siRNA、TLR4 過(guò)表達(dá)載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），抗NF-κB p65 抗體ab7970（Abcam 公司，英國(guó)），抗TLR-4 抗 體sc-10741（Santa Cruz Biotechnology，美國(guó)），超敏ECL 發(fā)光液（蘇州新賽美生物科技有限公司），PVDF 膜（Millipore 公司，美國(guó)），甲基噻唑藍(lán)（MTT）比色法試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）（南京建成生物工程研究所）。

1.2.2 主要儀器 光鏡（OLYMPUS BX50，日本），熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（培清生物科技有限公司），低溫離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國(guó)），電泳槽、轉(zhuǎn)移槽及其配件（Bio-rad 公司，美國(guó)），恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo fisher，美國(guó)），離心機(jī)（MD spectraMax 190，美國(guó)），水浴箱（東臺(tái)市躍進(jìn)電器廠），普通聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（Thermo fisher，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照組 對(duì)照組心肌細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)：將心肌細(xì)胞于37 ℃、含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d 傳代1 次，取2～4 代細(xì)胞。

1.3.2 心肌細(xì)胞損傷組 心肌細(xì)胞損傷組心肌細(xì)胞建立缺血再灌注損傷模型：將心肌細(xì)胞置于適宜濃度種板，細(xì)胞融合度在80%～90%時(shí)使用4 mmol/L 連二亞硫酸鈉清除培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣導(dǎo)致缺氧1 h，后轉(zhuǎn)換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。

1.3.3 預(yù)處理組 預(yù)處理組心肌細(xì)胞先給予右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20090248）1 μmol/L 預(yù)處理1 h，后建立缺血再灌注損傷模型，方法同心肌細(xì)胞損傷組。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心肌細(xì)胞形態(tài) 將三組心肌細(xì)胞分別接種于6孔培養(yǎng)板（2 ml），于37 ℃、含5%二氧化碳環(huán)境下DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，使用光鏡（×200）觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4.2 細(xì)胞存活率 三組心肌細(xì)胞分別接種于96 孔培養(yǎng)板中，加入5 g/L MTT 溶液20 μl，于37 ℃、5%二氧化碳環(huán)境下DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，吸凈培養(yǎng)液后加入DMSO 150 μl，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)490 nm 處光密度值（OD），各組均重復(fù)3 次并取平均值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.3 炎性因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量 采用RT-PCR 檢測(cè)三組心肌細(xì)胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）mRNA 相對(duì)表達(dá)量，嚴(yán)格按照RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.3.1 總RNA 提取 調(diào)整細(xì)胞密度并接種于6 孔板，每組3 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行藥物預(yù)處理，建立缺氧/復(fù)氧模型，使用PBS 徹底清洗，給予1 ml Trizol 進(jìn)行消化、裂解5 min，12 000 ×g 離心5 min，按照200 μl 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，室溫放置15 min。4 ℃ 12 000 ×g 離心15 min，取上層水相置于另一離心試管內(nèi)，按照0.5 ml 異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇，室溫放置15 min。4 ℃ 12 000 ×g 離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇，4 ℃ 8 000 ×g 離心5 min，置于室溫5～10 min。20 μl DEPC H2O 溶解，55～60 ℃，5～10 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)260 nm 和280 nm 的OD 及其比值，檢測(cè)RNA 濃度和純度，1.9～2.0 表示RNA 純度較高。

1.4.3.2 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)檢測(cè)RNA 濃度計(jì)算RNA 模板反轉(zhuǎn)錄的上樣量：模板上樣量=1 000 μg/C，按5×All-In-One RT MasterMix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)條件：42 ℃，60 min；70 ℃，5 min；4 ℃終止反應(yīng)。

1.4.3.3 PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成完成。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 min，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，80 ℃讀板1 s，共40 個(gè)循環(huán)后繪制熔解曲線，72 ℃再延伸5 min。

1.4.3.4 目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量 內(nèi)參基因均為β-actin，熒光定量PCR 檢測(cè)離心試劑管內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到所設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)即CT 值，目的基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT×100%；ΔΔCT=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值。

1.4.4 TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量 采用Western blot 法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量，具體如下：提取蛋白：使用細(xì)胞裂解液充分裂解心肌細(xì)胞，采用細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提細(xì)胞核蛋白，采用BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，后水浴鍋煮，80 ℃，10 min；配置濃縮膠：恒壓80 V，Marker 分層后升至120 V 進(jìn)行電泳；轉(zhuǎn)膜：恒流200 mA，時(shí)間90～120 min，保持低溫；封閉：PVDF 膜置于5%的脫脂牛奶中進(jìn)行封閉，搖床70 次/min，室溫封閉2 h 或4 ℃過(guò)夜；剪膜+洗膜：根據(jù)目的蛋白分子量和Marker 指示將膜剪開(kāi)，TBST 液洗3 次，15 min/次；孵育Ⅰ抗，室溫4 h 或4 ℃過(guò)夜；洗膜后孵育Ⅱ抗，室溫2 h；洗膜后經(jīng)超敏ECL 發(fā)光液處理，采用JS-8608 凝膠成像分析儀分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué) 對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜表明光滑；心肌細(xì)胞損傷組心肌細(xì)胞形態(tài)不一，存在心肌細(xì)胞凋亡、脫落、漂浮現(xiàn)象；預(yù)處理組心肌細(xì)胞由缺氧-復(fù)氧損傷引起的形態(tài)學(xué)改變減輕，見(jiàn)圖1。

2.2 心肌細(xì)胞存活率 對(duì)照組心肌細(xì)胞存活率為（1.00±0.52）%，心肌細(xì)胞損傷組為（0.48±0.09）%，預(yù)處理組為（0.67±0.10）。三組心肌細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.451，P＜0.01）；心肌細(xì)胞損傷組、預(yù)處理組心肌細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；預(yù)處理組心肌細(xì)胞存活率高于心肌細(xì)胞損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 炎性因子mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 三組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；心肌細(xì)胞損傷組、預(yù)處理組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，預(yù)處理組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于心肌細(xì)胞損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）

圖1 光學(xué)顯微鏡下三組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（標(biāo)尺100 μm，×200）Figure 1 Morphological changes of cardiomyocytes in the three groups of rats under optical microscope

表1 三組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（x± s）Table 1 Comparison of relative mRNA expression quantity of TNF-α，IL-6 and IL-1β in three groups

2.4 心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量 三組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F 值分別為13.665、18.045，P 值＜0.01）；心肌細(xì)胞損傷組、預(yù)處理組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，預(yù)處理組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于心肌細(xì)胞損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖2～3）。

3 討論

研究表明，氧自由基釋放增多、鈣超載、心肌細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、心肌細(xì)胞能量代謝障礙等均參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展［5-7］。TLR4 是參與機(jī)體固有免疫的主要特異性受體，能夠識(shí)別革蘭陰性菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而上調(diào)炎性因子表達(dá)。研究表明，心肌細(xì)胞膜上廣泛存在TLR4，并與心肌細(xì)胞功能相關(guān)［8］。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，敲除小鼠心肌細(xì)胞上TLR4 基因后缺血再灌注損傷所致炎性反應(yīng)明顯減輕［9］，提示心肌細(xì)胞膜上TLR4 受體與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)。右美托咪定為腎上腺素受體激動(dòng)劑，其能夠減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥，分析其原因可能與下調(diào)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)［10］。

圖2 三組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白電泳結(jié)果Figure 2 Protein electrophoresis results of TLR4 and NF-κB in the three groups

圖3 三組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 3 Comparison of relative protein expression quantity of TLR4 and NF-κB in the three groups

XU 等［11］研究表明，缺氧-復(fù)氧會(huì)降低大鼠心肌細(xì)胞存活率。本研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞損傷組、預(yù)處理組心肌細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，提示經(jīng)缺血再灌注后心肌細(xì)胞損傷程度加重。但本研究結(jié)果顯示，預(yù)處理組心肌細(xì)胞由于缺氧-復(fù)氧損傷引起的形態(tài)學(xué)改變減輕，且預(yù)處理組心肌細(xì)胞存活率高于心肌細(xì)胞損傷組，提示右美托咪定能減輕缺血再灌注后心肌細(xì)胞損傷程度。

TNF-α、IL-6、IL-1β 均是缺血再灌注損傷過(guò)程中的重要炎性因子，其中TNF-α 能促使炎性細(xì)胞向缺血區(qū)浸潤(rùn)［11］；IL-6 在炎性反應(yīng)中具有調(diào)控作用，其能加重機(jī)體炎性損傷程度［12］；IL-1β 具有誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附和聚集等作用［13］。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，TNF-α、IL-6、IL-1β 參與急性心肌梗死、缺血再灌注損傷等［14-15］，分析其原因可能與參與多種信號(hào)傳導(dǎo)通路如GPR37/JNK/PPAR-γ、TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)［16-17］。本研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞損傷組、預(yù)處理組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，預(yù)處理組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于心肌細(xì)胞損傷組，提示右美托咪定能有效減輕心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞損傷組、預(yù)處理組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，預(yù)處理組心肌細(xì)胞TLR4、NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于心肌細(xì)胞損傷組，提示右美托咪定能通過(guò)下調(diào)心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路而減輕心肌缺血再灌注損傷程度。

綜上所述，右美托咪定能有效改善大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞存活率，減輕炎性反應(yīng)，其可能通過(guò)下調(diào)心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB 信號(hào)通路而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷程度。

作者貢獻(xiàn)：任小鵬、潘龍飛進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究實(shí)施與可行性分析，對(duì)結(jié)果分析與解釋，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；孫春喜、李建成進(jìn)行數(shù)據(jù)收集及整理；高彥霞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；任小鵬負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文并修訂；潘龍飛對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益了沖突。