高效液相色譜法測(cè)定順氣通腑合劑中蘆薈大黃素的含量

殷生楠，李進(jìn)冬，李智勤

（1.泰州市中醫(yī)院；2.泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 225300）

順氣通腑合劑為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：蘇藥制字Z0400181866），處方組成：生大黃、黨參、白術(shù)、土茯苓、木香等多味中藥。功效：益氣健脾，順氣通腑，降氣排氣，促進(jìn)腸蠕動(dòng)。在治療各種腹部手術(shù)后腹脹、腑氣不通方面具有較好的療效。目前，順氣通腑合劑質(zhì)量控制僅為裝量、PH、微生物、相對(duì)密度等通則檢查項(xiàng)，而對(duì)于藥性較強(qiáng)的大黃并未要求含量測(cè)定，不便較好控制合劑質(zhì)量。處方中君藥大黃具有瀉下攻積，清熱解毒，逐淤通經(jīng)等功效[1]，研究表明[2]，大黃蒽醌類成分具有一定的肝損傷、腎損傷、腸毒性。蘆薈大黃素作為大黃蒽醌類主要成分之一，其質(zhì)量研究并不多見，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，蘆薈大黃素易溶于甲醇中，所以本研究中采用甲醇作為提取溶劑。本文旨在建立順氣通腑合劑中蘆薈大黃素的含量測(cè)定方法，用以控制順氣通腑合劑的質(zhì)量，保證制劑的安全性及穩(wěn)定性，為順氣通腑合劑由醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑轉(zhuǎn)變?yōu)樗帍S產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 試劑與儀器

L-2000系列高效液相色譜儀（日本日立公司）；色譜柱為GRACEC18(4.6mm×250mm，5μm)；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）。ELl04電子天平購自梅特勒．托利多儀器上海有限公司。

順氣通腑合劑來源于泰州市中醫(yī)院，20180705、20180807、20180902（批準(zhǔn)文號(hào)：蘇藥制字Z0400181866）；蘆薈大黃素對(duì)照品（110795-201710）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；磷酸為色譜純（徐州市科翔化學(xué)試劑有限責(zé)任公司），水為娃哈哈牌純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex-C18柱（5um，4.6mm×250mm），以甲醇-0.1%磷酸 溶液 （85：15）為色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫30℃，流速為1.0 ml/min，理論塔板數(shù)按蘆薈大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素5.08mg置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得對(duì)照品溶液備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取順氣通腑合劑2ml，置100 ml錐形瓶中，加8%鹽酸溶液10ml，超聲2min，再加三氯甲烷10ml，加熱回流1h，放冷，置分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻、用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按照順氣通腑合劑處方及制備工藝制備缺蘆薈大黃素的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備陰性對(duì)照品溶液。

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μl入高效液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果表明，陰性對(duì)照在蘆薈大黃素保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)。色譜見圖1。

圖1 順氣通腑合劑 HPLC 色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0、2、4、6、8、10 μl注入高效液相色譜儀，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（C），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果為：蘆薈大黃 素 A=37.224C+3.016，r=0.9999， 線 性 范 圍1.705～34.104 μg/ml。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算蘆薈大黃素色譜峰面積的RSD值分別為0.98%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取順氣通腑合劑（批號(hào)20180705）按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12、24 h 分別進(jìn)樣 10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算RSD值蘆薈大黃素色譜峰面積的RSD均小于1.0%(n=8)。結(jié)果表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取順氣通腑合劑（批號(hào)20180705）按“2.2.2”項(xiàng)下平行制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μl，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算蘆薈大黃素色譜峰面積的RSD值分別1.63%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取順氣通腑合劑500 μl，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，每一質(zhì)量濃度取3份，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率和RSD。蘆薈大黃素回收率和RSD為100.7%(RSD=1.31%,n=9)。

2.5 樣品含量測(cè)定 取三批順氣通腑合劑（批號(hào)20180705、20180807、20180902）每批各三份。精密量取1 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積。采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算順氣通腑合劑中蘆薈大黃素的含量，結(jié)果見表1。

表1 順氣通腑合劑中蘆薈大黃素測(cè)定結(jié)果（質(zhì)量分?jǐn)?shù)/mg·ml-1，n=3）

3 討論

順氣通腑合劑是臨床療效確切的醫(yī)院制劑，處方中大黃為主藥，而蘆薈大黃素是其中的主要蒽醌類成分。有報(bào)道指出[4]，大黃提取物雖有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃等功效，但隨著其劑量的增加對(duì)肝、腎、腸具有一定毒性。為進(jìn)一步提高制劑的質(zhì)量，保證患者的用藥有效安全，筆者建立了測(cè)定制劑中蘆薈大黃素的質(zhì)量控制方法，采用HPLC法對(duì)順氣通腑合劑中蘆薈大黃素進(jìn)行含量測(cè)定，提高了醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

大黃中蘆薈大黃素的測(cè)定方法有報(bào)道過，但在醫(yī)院制劑中檢測(cè)蘆薈大黃素尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)掃描，同時(shí)參考文獻(xiàn)報(bào)道方法[5,6]，最終在254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)蘆薈大黃素。把對(duì)照品存放于4℃冰箱中，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)同一濃度樣品的吸收面積，蘆薈大黃素RSD均小于1.0%，表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。對(duì)同一批號(hào)的順氣通腑合劑平行測(cè)定6次，測(cè)其吸收面積，蘆薈大黃素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.26%，表明此方法能夠重復(fù)操作。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過建立蘆薈大黃素成分的高效液相色譜測(cè)定方法，明確了順氣通腑合劑的檢測(cè)項(xiàng)目，可較為穩(wěn)定地測(cè)定制劑含量，從而更好地控制制劑質(zhì)量。本法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性高，可用于實(shí)際生產(chǎn)和醫(yī)藥制劑的質(zhì)量控制，有利于藥品標(biāo)準(zhǔn)的升級(jí)完善。