Ⅱ型糖尿病動物模型構(gòu)建的研究進展

唐藝丹，王鮮忠，張姣姣

(西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 400715)

近年來糖尿病患病率和死亡率明顯增加，在我國已成為了繼心血管疾病和腫瘤之后位列第三位的多發(fā)病和慢性非傳染性疾病。在糖尿病患者中，Ⅱ型糖尿病約占90%以上[1]。Ⅱ型糖尿病主要由胰島素抵抗和胰島素分泌不足引起[2]，構(gòu)建糖尿病動物模型能夠較好地模擬糖尿病的發(fā)生與發(fā)展過程，有利于揭示糖尿病的發(fā)病機制以及治療藥物的篩選[3]，在生物醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。構(gòu)建不同的糖尿病動物模型有利于進行不同領(lǐng)域的糖尿病研究，如糖尿病引起的心血管病變、腎病、神經(jīng)病變及糖尿病足等。傳統(tǒng)構(gòu)建Ⅱ型糖尿病動物模型的方法主要包括自發(fā)性和誘導(dǎo)性建模，其方法較成熟，操作簡單，能更好地模擬Ⅱ型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展過程。嚙齒類動物(如大鼠、小鼠)的基因組與人類基因組具有較高的同源性，并且關(guān)于嚙齒類動物基因圖譜的研究較為成熟，因此，嚙齒類動物常用作動物模型來進行病理機制的研究和藥物研發(fā)。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建相關(guān)基因型的Ⅱ型糖尿病動物模型，有利于從基因和分子水平上闡述人類糖尿病的發(fā)病機制。本文在概述自發(fā)性和誘導(dǎo)性Ⅱ型糖尿病動物模型構(gòu)建的基礎(chǔ)上，著重闡述了利用基因工程技術(shù)構(gòu)建Ⅱ型糖尿病動物模型的方法及其造模機制，分析了不同Ⅱ型糖尿病動物模型的優(yōu)點、缺點和適用范圍，為揭示糖尿病的發(fā)病機制及治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 自發(fā)性Ⅱ型糖尿病動物模型

自發(fā)性Ⅱ型糖尿病動物模型是指在自然條件下，未經(jīng)過人工處理而發(fā)生Ⅱ型糖尿病的實驗動物，利用自發(fā)性Ⅱ型糖尿病的動物進行育種，其后代仍患Ⅱ型糖尿病。目前篩選成功并能作為種系保存下來的自發(fā)性糖尿病動物模型主要是嚙齒類動物[4]。自發(fā)性Ⅱ型糖尿病模型動物的糖尿病發(fā)生和發(fā)展過程及表現(xiàn)與人類的Ⅱ型糖尿病相似，尤其是在多基因模型中，適合于構(gòu)建糖尿病及其他代謝性疾病等多因素疾病模型以及糖代謝缺陷模型[5]。主要缺點是來源相對較少，價格昂貴，繁殖和飼養(yǎng)條件嚴格，而且頻繁的同系繁殖造成的單基因遺傳使模型動物糖尿病的發(fā)生和發(fā)展特性與人類糖尿病有所差異[6]。

1.1 近遠雜交系

1.1.1 GK(Goto-Kakizaki)大鼠

GK大鼠是Wistar大鼠經(jīng)過口服糖耐量實驗后篩選出輕度糖耐量減退的大鼠，經(jīng)過10代左右反復(fù)選擇高血糖鼠進行交配，最后形成與人類Ⅱ型糖尿病近似的自發(fā)性非肥胖Ⅱ型糖尿病的鼠種[7]。GK大鼠主要表現(xiàn)為葡萄糖耐受不良，β細胞分泌受損，空腹高血糖和高脂血癥，肝糖原生成增多，肝、肌肉和脂肪組織出現(xiàn)中度胰島素抵抗等，長期患病后出現(xiàn)腎、心臟并發(fā)癥和神經(jīng)元衰退及認知障礙[8]。因此，GK大鼠已廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病研究的各個方面，不僅包括糖尿病的胰島素分泌缺陷以及β細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能紊亂等研究，還涉及糖尿病各種并發(fā)癥的研究。因此利用GK大鼠模型有利于從組織學(xué)、病因?qū)W、病理學(xué)等多個角度揭示Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的致病機理。

1.1.2 OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠

OLETF大鼠是利用Long-Evans大鼠進行遠系雜交后，選擇體重 ＞400 g的雄性后代與體重在正常范圍的9～10周的雌性后代進行交配，然后經(jīng)過20代的傳代篩選得到體形肥胖的Ⅱ型糖尿病大鼠模型。OLETF大鼠除了表現(xiàn)胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂外，還表現(xiàn)出肥胖，因此該動物模型適合于研究由肥胖引起的Ⅱ型糖尿病[9]。由于OLETF大鼠的膽囊收縮素A型受體(cholecystokinin type A receptor，CCKAR)的基因表達完全缺失，因此OLETF大鼠常表現(xiàn)為出現(xiàn)食欲亢進和肥胖，此外，OLETF大鼠X染色體上的ODB1基因和14號染色體上的ODB2基因與Ⅱ型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)[10]。因此，OLETF大鼠模型可作為 CCKAR、ODB1、ODB2基因研究的動物材料。

1.2 基因缺陷型

1.2.1 db/db小鼠

db/db小鼠4號染色體的瘦素受體基因發(fā)生缺陷，從而導(dǎo)致自發(fā)性Ⅱ型糖尿病。db/db小鼠的主要表現(xiàn)為肥胖、高血糖、高血脂和糖尿等癥狀，其生理與行為特征與人類Ⅱ型糖尿病的表現(xiàn)極為相似[11]。

1.2.2 KKay小鼠

KKay小鼠是將黃色肥胖基因轉(zhuǎn)入KK小鼠而形成的Ⅱ型糖尿病動物模型。KKay小鼠的主要表現(xiàn)為肥胖、葡萄糖不耐受和胰島素抵抗等，與人類Ⅱ型糖尿病相似，尤其是腎小球的病理變化與人類糖尿病腎病早期觀察到的病理變化一致，并且KKay小鼠由糖尿病并發(fā)的腎組織病變比KK小鼠嚴重[12]。

2 誘導(dǎo)性Ⅱ型糖尿病動物模型

誘導(dǎo)性Ⅱ型糖尿病動物模型是指通過物理、生物和化學(xué)等致病因素，損傷動物胰或胰島細胞進而導(dǎo)致胰島素缺乏，或運用各種拮抗劑對抗胰島素的作用，人工誘導(dǎo)具有Ⅱ型糖尿病特征的動物模型。構(gòu)建誘導(dǎo)性Ⅱ型糖尿病動物模型應(yīng)從致病原因的角度來模擬人類Ⅱ型糖尿病，避免只從病態(tài)反應(yīng)進行模擬。構(gòu)建誘導(dǎo)性Ⅱ型糖尿病模型的方法比較簡單，造模率較高，目前廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的研究，但缺點是造模時間較長。

2.1 胰腺切除法

胰腺切除法是最早的糖尿病動物模型的構(gòu)建方法。狗的胰腺被切除后，出現(xiàn)多尿、多飲、多食和嚴重的糖尿現(xiàn)象[5]。切除胰腺的豬的葡萄糖耐量低于正常，從而可構(gòu)建糖尿病模型[13]。但胰腺切除法單獨使用一般是構(gòu)建Ⅱ型糖尿病模型，要構(gòu)建Ⅱ型糖尿病模型還需要聯(lián)合其他化學(xué)藥物，如鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、四氧嘧啶等[14]。

2.2 膳食誘導(dǎo)法

膳食誘導(dǎo)法是目前較為簡單方便的糖尿病動物模型的構(gòu)建方法，一般利用高糖高脂的飼料連續(xù)飼喂實驗動物，其原理為糖在體內(nèi)直接可導(dǎo)致高血糖，在長期高糖膳食誘導(dǎo)下引起糖代謝異常，繼而導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病，此外，高脂引起的脂代謝異常，進而導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病。沙鼠在飼喂高能膳食后表現(xiàn)出糖尿病癥狀，出現(xiàn)肌胰島素抵抗、β細胞功能失常、胰島素前體分泌增加、胰島素信號通路失活[15]。在廣西巴馬小型豬[16]以及非人靈長類動物如食蟹猴[17]上使用膳食誘導(dǎo)法都成功誘導(dǎo)出了糖尿病癥狀。膳食誘導(dǎo)法目前主要用于構(gòu)建糖尿病大動物模型，有利于糖尿病血管并發(fā)癥等疾病的相關(guān)研究。

2.3 化學(xué)藥物誘導(dǎo)法

2.3.1 STZ

STZ是目前使用最廣泛的糖尿病動物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑，它能對哺乳動物胰島β細胞產(chǎn)生特異性毒性，STZ主要通過產(chǎn)生自由基損傷β細胞的功能，引起胰島素合成減少，從而誘發(fā)糖尿病[18]。為了取得良好的Ⅱ型糖尿病造模效果，STZ常與胰腺切除法聯(lián)合使用。通過手術(shù)切除實驗動物的胰腺鉤突及體尾部，然后局部或全身注射STZ，進而構(gòu)建胰島素分泌不足的Ⅱ型糖尿病動物模型[19]。這種方法的優(yōu)點是克服了切除全部胰所致的其他器官的嚴重創(chuàng)傷，且避免了大劑量使用STZ對其他組織器官的嚴重損傷。此外，STZ還可以聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病。高脂飼料誘導(dǎo)大鼠6～8周后出現(xiàn)胰島素抵抗，然后腹腔注射小劑量的STZ，Ⅱ型糖尿病的造模成功率可達79%[20]。STZ的劑量受高能飲食喂養(yǎng)時間的影響，高能飲食誘導(dǎo)的時間越長，動物的胰島素抵抗表現(xiàn)越明顯，所需的STZ劑量就相應(yīng)減少[21]，STZ給藥途徑或者模型建立的標準不同也會造成所需STZ的劑量出現(xiàn)差異。

2.3.2 四氧嘧啶

四氧嘧啶的機理與STZ相似，主要通過產(chǎn)生超氧自由基破壞β細胞，導(dǎo)致胰島素合成減少，但與STZ相比，四氧嘧啶引起的高血糖癥具有不穩(wěn)定性和可逆性。因此，由四氧嘧啶引起的糖尿病模型不足以恰當?shù)卦u估抗糖尿病藥物的降血糖作用[22]。一次性腹腔注射四氧嘧啶的劑量在100～250 mg/kg范圍內(nèi)，造模成功率與注射劑量呈正相關(guān)，死亡率與注射劑量呈負相關(guān)。研究表明腹膜內(nèi)給藥170 mg/kg和200 mg/kg的四氧嘧啶的致糖尿病作用在兩個劑量之間沒有顯示出顯著(P＜0.05)差異，造模成功率高達90%。但在死亡率上，170 mg/kg劑量組的死亡率較低[23]。

3 基因工程糖尿病動物模型

基因工程糖尿病動物模型是利用基因修飾技術(shù)對特定DNA片段進行定點敲除、敲入以及替換來實現(xiàn)基因表達的上調(diào)或下調(diào)，從而構(gòu)建相關(guān)基因型的Ⅱ型糖尿病動物模型。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的Ⅱ型糖尿病動物模型可以穩(wěn)定遺傳，有利于研究Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制和潛在的新療法[24]。Ⅱ型糖尿病是由多個基因表達改變聯(lián)合環(huán)境和遺傳因素等共同引起的，而基因工程構(gòu)建的Ⅱ型糖尿病動物模型具有較高的單基因模擬，因此很難完全模擬臨床實際中的Ⅱ型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展過程。相信隨著基因工程技術(shù)的進步，穩(wěn)定遺傳的基因工程動物將會成為研究Ⅱ型糖尿病的主要模型。

3.1 Ⅱ型糖尿病相關(guān)基因

外周組織器官的胰島素抵抗和胰島β細胞分泌功能障礙是Ⅱ型糖尿病發(fā)病過程中的兩個重要環(huán)節(jié)，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷是產(chǎn)生胰島素抵抗和影響胰島素分泌的重要機制[25]。胰島素、胰島素受體(insulin receptor，IR)、胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)、胰島素樣生長因子1受體(insulin like growth factor 1 R，IGF1R)是常見的糖尿病相關(guān)基因[26]。胰島素與IR結(jié)合后可以激活酪氨酸激酶，使IRS發(fā)生磷酸化，磷酸化的IRS可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB)信號通路。PKB一方面可以直接激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，另一方面還可以通過結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體(tuberous sclerosis complex，TSC)間接調(diào)控mTOR的表達[27]，進而影響糖轉(zhuǎn)運蛋白的合成和降低血糖水平[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，IR基因缺失純合子(IR-/-)小鼠在出生不久后會出現(xiàn)代謝紊亂、生長遲緩、輕度胰島素抵抗、β細胞增生和高胰島素血癥[21]；IRS-1基因缺失純合子(IRS-1-/-)小鼠在成年后出現(xiàn)胰島素抵抗與β細胞增生[21]。類胰島素生長因子1(insulinlike growth factor 1，IGF1)與IR具有相似的結(jié)構(gòu)，可通過與IGF1R結(jié)合來介導(dǎo)類胰島素效應(yīng)，IGF1基因缺失患者表現(xiàn)出嚴重的胰島素抵抗與高血糖水平[30]。

瘦素與Ⅱ型糖尿病的發(fā)生也有密切關(guān)系。瘦素與瘦素受體相結(jié)合后，通過兩條途徑發(fā)揮其生理功能。一是作用于下丘腦的代謝調(diào)節(jié)中樞，抑制食欲、減少能量攝入，即中樞途徑。二是影響胰島素的釋放、葡萄糖的吸收及代謝等方面，即外周途徑[31]。在外周途徑中，瘦素通過Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)依賴性途徑激活肝細胞中AMP激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)[32]，并影響mTOR信號通路，進而調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的易位和細胞表面水平。瘦素缺乏或瘦素抵抗能夠影響機體脂代謝和糖代謝的過程，從而誘發(fā)Ⅱ型糖尿病[33]。此外，轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(transcription factor 7 like 2，TCF7L2)基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與Ⅱ型糖尿病相關(guān)性最強的基因之一，有調(diào)節(jié)胰島素分泌、外周胰島素抵抗以及維持血糖水平穩(wěn)定的功能[34]，TCF7L2基因變異型患者的胰島素分泌水平降低，更易患Ⅱ型糖尿病[35]。葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)是肝細胞和胰島β細胞中葡萄糖代謝途徑中的第一個關(guān)鍵酶，對于血糖穩(wěn)態(tài)的維持具有重要的調(diào)節(jié)作用。腫瘤壞死因子受體超家族成員9(tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9)基因可以通過編碼CD137影響非肥胖糖尿病(no obesity diabetes，NOD)小鼠的糖尿病進程，T細胞在敲除TNFRSF9基因后可促進Ⅱ型糖尿病的發(fā)展[36]。胰十二指腸同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1)在胰腺發(fā)育及β細胞功能維持中起重要調(diào)控作用，PDX1基因純合缺失會導(dǎo)致胰腺發(fā)育不全，胰島素分泌障礙，從而導(dǎo)致糖尿病[37]。ATP敏感性鉀(ATP-sensitive potassium channel，K-ATP)通道的亞基內(nèi)向整流鉀通道(Kir6.2)也能夠調(diào)節(jié)胰島素分泌，當血糖濃度升高時，β細胞代謝活躍，產(chǎn)生大量ATP，ATP與Kir 6.2結(jié)合后使K-ATP通道關(guān)閉，引起細胞膜去極化，使電壓依賴性的鈣離子通道開放，鈣離子內(nèi)流引起胰島素釋放[38]。因此，這些與糖尿病相關(guān)的基因常被選擇作為基因工程改造的對象，以模擬糖尿病的發(fā)生。

3.2 基因工程技術(shù)在Ⅱ型糖尿病動物模型中的應(yīng)用

3.2.1 胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)打靶

ES細胞打靶是通過同源重組技術(shù)對特定位點的基因進行改造，使兩個同源區(qū)域之間發(fā)生基因組重排，然后通過顯微注射或者胚胎融合的方法將ES細胞引入受體胚胎內(nèi)，最后獲得能穩(wěn)定遺傳的基因修飾的動物模型[39]。目前已有使用ES打靶技術(shù)獲得的相關(guān)Ⅱ型糖尿病動物模型。利用ES打靶技術(shù)敲除小鼠的TCF7L2基因后，在高脂飲食的誘導(dǎo)下，小鼠的葡萄糖耐量降低、胰島素敏感性受損、胰島素分泌減少、體重增加和脂肪組織增加[40]；利用ES打靶技術(shù)敲除小鼠GCK基因的C57BL6J位點，其后代小鼠的空腹血糖水平顯著增加，葡萄糖耐量降低[41]；利用ES打靶技術(shù)敲除小鼠Kir6.2基因后，K-ATP通道被激活，使β細胞對高糖刺激失去反應(yīng)，鈣離子不能內(nèi)流，進而降低了胰島素的分泌[42]。因此，通過ES打靶技術(shù)可構(gòu)建胰島素分泌不足的Ⅱ型糖尿病動物模型。

3.2.2 基因編輯技術(shù)

基因編輯是利用核酸酶對DNA片段進行靶向修飾的一種基因工程技術(shù)。常用的核酸工具酶包括鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及CRISPR相關(guān)核酸酶(CRISPR associated，Cas)系統(tǒng)。相比于傳統(tǒng)的細胞打靶技術(shù)，基因編輯技術(shù)更易操作[43]，建模效率更高，并且可以同時實現(xiàn)單個基因或多個基因的改變[44]。

(1)ZFNs由重復(fù)的鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP)和FokI核酸內(nèi)切酶組成，鋅指蛋白用于識別和結(jié)合特定的基因序列，F(xiàn)okI核酸內(nèi)切酶可以特異性切割目的基因[45-46]，然后DNA雙鏈發(fā)生斷裂，細胞通過同源重組或非同源末端連接進行DNA修復(fù)。因此，通過人為設(shè)計引入堿基突變、片段替換、插入或缺失可以實現(xiàn)基因的定點修飾。利用ZFNs技術(shù)，通過胚胎顯微注射直接有效地敲除NOD小鼠的TNFRSF9基因，已成功構(gòu)建出Ⅱ型糖尿病小鼠模型[47]。由于各個ZFP之間能相互干擾，易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，在使用上有局限性，因此Nishio等[48]對ZFNs進行了優(yōu)化，通過DNA適體將ZFNs與綠色熒光蛋白基因進行結(jié)合，然后轉(zhuǎn)染到HEK293細胞內(nèi)，這樣ZFP之間的相互干擾就會明顯降低，ZFNs的基因編輯建模效率顯著提高。

(2)TALENs由激活因子樣效應(yīng)物和FokI核酸酶組成，激活因子樣效應(yīng)物能特異性識別和結(jié)合DNA堿基對，F(xiàn)okI核酸酶能在特定位點切斷DNA雙鏈[49-50]，進而激活 DNA雙鏈的修復(fù)機制。與ZFNs技術(shù)相比，TALENs設(shè)計更簡單，特異性更高，但模塊組裝過程較繁瑣，具有一定的細胞毒性[51]。TALENs技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種模式動物的基因組修飾。利用TALENs技術(shù)對PDX1基因進行編輯后，獲得了PDX1缺陷豬，表現(xiàn)為胰腺缺乏，但胃腸道和其他內(nèi)臟器官顯示正常[39]。由于胰腺切除法較難完全切除胰腺，或者在充分切除胰腺時可能損傷到其他組織[52]，因此，利用TALENs技術(shù)構(gòu)建的先天性胰腺缺乏的糖尿病動物模型要優(yōu)于胰腺切除法構(gòu)建的模型。

(3)CRISPR/Cas是一種 RNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合體，由成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR和Cas核酸酶組成。CRISPR/Cas9復(fù)合物能在一段小RNA指導(dǎo)下，通過PAM序列定向?qū)ふ夷繕薉NA，然后對DNA雙鏈進行切割，從而啟動DNA雙鏈的修復(fù)。

目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)廣泛用于胚胎水平的基因編輯，從而獲得基因修飾的動物模型[53]。利用CRISPR/Cas9敲除胰島素基因后，仔豬的胰腺中胰島素不表達，出現(xiàn)血糖升高和糖尿等癥狀[54]。利用CRISPR/Cas9敲除β細胞的IR，高脂飲食小鼠的PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達量下降，導(dǎo)致葡萄糖耐受不良，進而出現(xiàn)Ⅱ型糖尿病癥狀[55]。利用CRISPR/Cas9敲除大鼠IRS基因，大鼠表現(xiàn)出糖耐受損傷，并伴隨有胰島素抵抗和高胰島素血癥等Ⅱ型糖尿病癥狀[56]。利用CRISPR/Cas9同時敲除IRS和瘦素受體基因后，大鼠模型出現(xiàn)肥胖、血脂異常、輕度血糖升高等糖尿病癥狀[57]。此外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除刺鼠相關(guān)肽神經(jīng)元中的瘦素受體基因后，小鼠模型出現(xiàn)體重增加、脂肪含量增加、高血糖癥等糖尿病癥狀[58]。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效地構(gòu)建基因缺失的糖尿病動物模型。

4 結(jié)語

構(gòu)建糖尿病的動物模型是研究糖尿病發(fā)病機制及研發(fā)新型治療藥物的關(guān)鍵，但目前尚沒有能夠完全模擬人類糖尿病發(fā)生發(fā)展過程的動物模型。本文總結(jié)了常用的構(gòu)建Ⅱ型糖尿病動物模型的方法，并比較了各種構(gòu)建方法的優(yōu)缺點。由于自發(fā)性糖尿病動物模型的血糖升高不顯著，化學(xué)誘導(dǎo)的動物模型成模率較低和死亡率較高，基因工程糖尿病動物模型耗時較長以及對技術(shù)設(shè)備和飼養(yǎng)環(huán)境要求較高等缺點，因此，在研究II糖尿病發(fā)病機制的過程中，要盡量選擇最合適的糖尿病動物模型，如何利用較低的成本在短時間內(nèi)成功構(gòu)建Ⅱ型糖尿病動物模型也是以后的研究需要解決的難題。