微型CT在血管鈣化動(dòng)物模型中的應(yīng)用進(jìn)展

王澤靜，王詢，肖康，張晶?

(1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院CT室，河北秦皇島 066000；2.河北省秦皇島市第一醫(yī)院心內(nèi)科，河北秦皇島 066000)

血管鈣化是鈣鹽過(guò)度沉積于血管壁導(dǎo)致的異位鈣化現(xiàn)象，是動(dòng)脈粥樣硬化的病理表現(xiàn)，是糖尿病、高血壓病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、腎功能衰竭等多種疾病的共有的病理生理過(guò)程[1]。CT作為動(dòng)物模型中血管鈣化分析的一種工具，能夠非破壞性的在三維創(chuàng)建目標(biāo)血管并定位和量化其鈣化程度，在動(dòng)脈粥樣硬化病理生理研究中有重要地位。對(duì)微型CT在血管鈣化動(dòng)物模型中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 研究動(dòng)脈鈣化的常用小動(dòng)物模型

由于小鼠和人類有許多共同的生理特征，小鼠可以為研究人類動(dòng)脈鈣化、畸形和主動(dòng)脈瓣鈣化的發(fā)病機(jī)制提供合適的模型。研究動(dòng)脈中膜鈣化常用慢性腎臟病的嚙齒類動(dòng)物模型。常見的慢性腎病的嚙齒動(dòng)物模型制做方法有：維生素D3超負(fù)荷、腺嘌呤注射和5/6腎切除術(shù)[2]。在這些模型中觀察到的鈣化通常是局灶性分布的，本質(zhì)上是“片狀”[3]，這與在慢性腎病患者中觀察到的鈣化模式相似[4]。研究動(dòng)脈內(nèi)膜鈣化常用載脂蛋白E基因(ApoE)敲除和低密度脂蛋白受體基因(LDLR)敲除的小鼠，在這類模型中可檢測(cè)到微鈣化和大鈣化[5]，這與人類血管的內(nèi)膜鈣化情況一樣。

2 研究動(dòng)脈鈣化的傳統(tǒng)方法

2.1 化學(xué)分析的方法

常用的方法是動(dòng)脈烤干稱重，放入鹽酸中溶解，取上清液測(cè)鈣含量，檢測(cè)吸光度值，計(jì)算出鈣含量。然而，使用這種方法酸性溶液將組織完全溶解破壞，并且測(cè)算到的鈣化不能區(qū)分是真正的組織鈣化還是僅僅含鈣超量。更重要的是這種方法無(wú)法對(duì)鈣化進(jìn)行血管定位和分布情況的分析。

2.2 組織學(xué)方法

常用的組織病理學(xué)鈣化染色技術(shù)包括：茜素紅S(Alizarin red S)鈣染色法和馮·科薩(Von kossa)染色法。二者的原理不同：茜素紅S鈣染色法：通過(guò)螯合技術(shù)，使鈣離子和茜素紅S產(chǎn)生復(fù)合物，來(lái)分析固定處理的細(xì)胞樣本中橘紅色鈣沉積。馮·科薩染色(Von kossa)利用鈣鹽中的磷酸根或碳酸根與硝酸銀溶液與反應(yīng)生成相應(yīng)的磷酸銀或碳酸銀，后者可在紫外線條件下還原為黑色的金屬銀。兩種方法各有利弊，茜素紅S和鈣離子復(fù)合物中，鈣質(zhì)容易從組織中溶解到溶液中，形成彌散物，相對(duì)不穩(wěn)定。而馮·科薩染色不直接檢測(cè)鈣離子，而是檢測(cè)與鈣離子結(jié)合的磷酸根或碳酸根，但是，磷酸根和碳酸根的存在并不意味著鈣離子一定存在，所以馮·科薩染色的特異性不強(qiáng)。

3 微型CT在血管鈣化動(dòng)物模型中的應(yīng)用

3.1 微型CT的分類

臨床工作中，血管鈣化的檢測(cè)幾乎完全依賴CT，目前螺旋CT的分辨率可以達(dá)到毫米級(jí)別，冠狀動(dòng)脈鈣化積分是評(píng)估冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展的方法之一，但是臨床CT的分辨率不足以用來(lái)觀察小鼠這一類動(dòng)物模型的血管鈣化情況。因此，分辨率可達(dá)微米的高分辨微型CT(Micro-CT)應(yīng)運(yùn)而生。按組裝模式分類，微型CT系統(tǒng)分為兩種[6]：(1)標(biāo)本旋轉(zhuǎn)型CT：X線球管和探測(cè)器固定：樣品在球管和探測(cè)器之間旋轉(zhuǎn)，可做上下和前后移動(dòng)?？臻g分辨率高，但掃描速度較慢，射線劑量大，多用于離體標(biāo)本掃描。(2)X線成像系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)型CT：原理和螺旋CT一致，X線球管和探測(cè)器運(yùn)動(dòng)，球管繞樣品旋轉(zhuǎn)。掃描速度快，射線劑量小，但空間分辨率較低，多用于活體動(dòng)物掃描。

3.2 微型CT與普通CT的區(qū)別

與普通CT成像原理相同，用X線束對(duì)被檢查對(duì)象一定厚度的層面進(jìn)行掃描，由探測(cè)器接收透過(guò)該層面的X線，經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)算法構(gòu)建圖像。與普通CT所不一樣的是[7]：(1)微型CT多使用平板探測(cè)器和錐形X線束，圖像采集的速度和射線利用率高于普通CT，以獲得各向同性容積圖像，并且有像素高、體素小的優(yōu)點(diǎn)，成像信息豐富，獲得的圖像能與組織病理學(xué)結(jié)果相匹配；(2)微型CT成像區(qū)域較小，空間分辨率較高，分辨率可達(dá)到1～10 μm；(3)微型CT微焦斑尺寸小于100 μm，且功率遠(yuǎn)小于普通CT，產(chǎn)生的X輻射較低。

3.3 軟組織增強(qiáng)微型CT

軟組織(比如血管)與支撐材料(比如石蠟)之間x射線衰減對(duì)比較低，從而影響成像質(zhì)量。使用重金屬染色可以克服這個(gè)問(wèn)題，常用的重金屬染色劑有：四氧化鋨[8]、磷鎢酸[9]和碘[10]。這些染色劑可以結(jié)合到樣品的內(nèi)部，提供更高的X線對(duì)比度。然而，染色劑的濃度和時(shí)間必須針對(duì)特定的組織類型做出調(diào)整。

3.4 其他軟組織CT成像方案

有的重金屬染色如磷鎢酸與隨后的組織學(xué)染色方案不兼容，包括HE染色和Weigert’s彈性蛋白染色，因此，工程師們研發(fā)了不依賴重金屬染色的軟組織CT成像方案[11]。

X射線相位襯度CT成像：相對(duì)于傳統(tǒng)的吸收成像，相位襯度CT成像原理是：X射線穿過(guò)物體時(shí)，物體內(nèi)部各部位折射率的差異引起光的折射的差異，導(dǎo)致相位的變化。適用于弱吸收材料物體(生物軟組織，聚合物)，還可以減少吸收劑量。相位襯度成像可以使血管等軟組織與周圍的支撐結(jié)構(gòu)的對(duì)比度提高1000倍以上。

K緣減影CT成像，操作原理是，每一種元素吸收光子能量可以有幾十倍的差異。即可使CT在某一元素的K吸收光子能量之下和之上兩次掃描成像，然后減影，這樣可以加大該特定元素的對(duì)比度，獲得高密度分辨。

散射CT與熒光減影CT成像無(wú)需染色，但由于對(duì)技術(shù)要求很高，尚未在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)成熟應(yīng)用。

在軟組織的CT圖像采集過(guò)程中，必須對(duì)軟組織進(jìn)行固定。首先使用酒精或玉米油的液體浸泡，然后使用瓊脂糖凝膠、塑料包埋樹脂、和石蠟等進(jìn)行組織包埋。

3.5 微型CT動(dòng)物模型中的血管鈣化典型案例

目前為止，僅少數(shù)研究利用實(shí)驗(yàn)室微型CT分析動(dòng)物模型中的血管鈣化。2013年Huesa等[12]對(duì)小鼠的主動(dòng)脈經(jīng)玉米油浸泡處理固定后，使用微型CT掃描并進(jìn)行三維重建，獲得大小為7～10 μm的各向同性體素，在這些三維重建的血管中對(duì)鈣化區(qū)域進(jìn)行了精確量化評(píng)估。整個(gè)主動(dòng)脈的鈣化情況被完整的呈現(xiàn)出來(lái)。該成像方案為研究主動(dòng)脈鈣化的發(fā)展和臨床干預(yù)的潛在治療提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。然而，該項(xiàng)研究的一個(gè)局限性是無(wú)法將3D CT數(shù)據(jù)與隨后的2D組織病理學(xué)分析結(jié)合起來(lái)。為克服這一問(wèn)題，Awan等人[13]使用動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的主動(dòng)脈用石蠟包埋，將同一動(dòng)脈的鈣化斑塊使用微型CT三維重建分析與二維組織學(xué)分析相結(jié)合。然而，在這些研究中血管壁鈣化斑塊和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的精細(xì)結(jié)構(gòu)并不能完美呈現(xiàn)，這主要是由于所使用的微型CT的分辨率(5～20 μm的各向同性體素)不夠。為克服血管鈣化研究分辨率低的問(wèn)題，使用多尺度CT掃描方法檢測(cè)和量化血管中的鈣化沉積，可以實(shí)現(xiàn)各向同性體素降至0.5 μm。Rawson等[14]將血管用福爾馬林固定、脫水并包埋在石蠟中，首先對(duì)整個(gè)血管進(jìn)行快速、低分辨率的CT掃描，以便在三維重建中顯示鈣化的位置和分布，然后以更高的分辨率對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)行掃描，以檢查鈣化斑塊和血管細(xì)胞外基質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)。這些更高分辨率的掃描可使用實(shí)驗(yàn)室CT實(shí)現(xiàn)0.5 μm的空間分辨率?；蛘呤褂脤?shí)驗(yàn)室納米CT(NCT)可以實(shí)現(xiàn)亞微米(例如150 nm)的分辨率。納米CT可以觀察到大鼠頸動(dòng)脈的內(nèi)膜[15]，隨后可以對(duì)蠟包埋的血管進(jìn)行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)甚至激光捕獲微型切割技術(shù)的研究[13，15-16]。

3.6 微型CT對(duì)于微鈣化的識(shí)別

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜鈣化的大小和分布與斑塊的破裂密切相關(guān)，微鈣化可以明顯增加斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)[17]。微型CT能夠檢測(cè)到血管中的微鈣化，這些微鈣化不容易被二維組織學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，除非分析連續(xù)的組織切片。血管壁和鈣化斑塊的X射線衰減是相似的，導(dǎo)致兩者之間的吸收對(duì)比度較低[18]。因此，斑塊和血管壁目前必須在軟件中手動(dòng)區(qū)分然后進(jìn)行量化分析。未來(lái)如果能將鈣化血管的3-D數(shù)據(jù)導(dǎo)入可隨時(shí)處理和分析平臺(tái)中，將大大提高微型CT分析血管鈣化的實(shí)用性。

3.7 微型CT在活體動(dòng)物模型血管鈣化研究中的應(yīng)用

微型CT能夠檢測(cè)活體動(dòng)物模型血管鈣化的進(jìn)展過(guò)程，從而受到廣泛關(guān)注?；铙w的微型CT可以在長(zhǎng)程的動(dòng)物研究中連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物血管鈣化的變化情況，而無(wú)需在多個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，這正符合動(dòng)物研究的 3R原則(reduction(減少)、replacement(替代)、refinement(優(yōu)化))。然而目前微型CT還沒有在嚙齒類動(dòng)物的活體研究中廣泛應(yīng)用，主要是因?yàn)槠胀ㄎ⑿虲T的的分辨率較低。高分辨的錐型束微CT的發(fā)展和廣泛應(yīng)用必將推動(dòng)嚙齒類動(dòng)物血管鈣化的活體研究。

3.8 微型CT與18F-NaF micro-PET/CT相結(jié)合

18F-NaF micro-PET/CT檢測(cè)活體動(dòng)物血管鈣化的敏感性和特異性很高，并且在臨床前研究中能夠非常好的區(qū)分大鈣化和微鈣化[18]。18F-NaF以離子鍵形式結(jié)合到磷酸鹽表面，更重要的是可結(jié)合到小鼠的不易被微型CT檢測(cè)到的小血管的鈣化表面[19]。F-NaF攝取情況是測(cè)量總鈣化表面積或鈣化斑塊代謝活動(dòng)程度的一種重要方式[20]。相反，微型CT卻無(wú)法測(cè)量鈣化區(qū)域的代謝程度。因此，將微型CT與18F-NaF micro-PET/CT相結(jié)合可以很好的檢測(cè)動(dòng)物血管的鈣化情況及病理過(guò)程。

4 總結(jié)

傳統(tǒng)上血管鈣化在動(dòng)物研究中使用2D組織學(xué)和化學(xué)分析的方法進(jìn)行研究分析。然而，這些技術(shù)有幾個(gè)缺點(diǎn)，包括切片導(dǎo)致的偽影，以及不能同時(shí)顯現(xiàn)鈣化的空間結(jié)構(gòu)和整條血管的鈣化程度。目前的CT 3D成像技術(shù)可以完整的重建鈣化的動(dòng)脈并提供準(zhǔn)確的量化信息。微型CT所具有的高空間分辨率使得微觀和宏觀鈣化得以區(qū)分和量化。將CT與18F-NaF micro-PET/CT相結(jié)合，可以增強(qiáng)體內(nèi)活動(dòng)的微鈣化的檢測(cè)，并加深我們對(duì)不同信號(hào)通路和藥物的作用機(jī)制。目前還可以檢測(cè)到血管的ECM變化，例如彈性蛋白的退化。更重要的是 3D微型CT的分析可以和2D的組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白組學(xué)處理相結(jié)合，提供同一血管片段的互補(bǔ)的信息，例如鈣化體積、鈣化負(fù)荷、信號(hào)機(jī)制。微型CT的技術(shù)進(jìn)步可以為活體研究提供更多的方法，從而使整個(gè)動(dòng)物血管的大鈣化斑塊和小鈣化斑塊同時(shí)成像，實(shí)現(xiàn)血管鈣化的實(shí)時(shí)分析。