非洲豬瘟檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

唐 迪，劉 迪，劉 林，王 眾，鄭 寧，鄭業(yè)魯

（廣東廣墾畜牧工程研究院有限公司，廣東 廣州 510640）

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Viruses，ASFV）引起的高發(fā)病率和死亡率的傳染病。ASFV是非洲豬瘟相關(guān)病毒科的唯一成員，為雙鏈DNA病毒，根據(jù)毒株的不同，基因組大小為170～190 kb，有 151～167 個(gè)開(kāi)放性閱讀框[1]。目前基于病毒主要衣殼蛋白p72可將ASFV分為24個(gè)基因型，基于病毒血凝素CD2樣蛋白（CD2V）和C型凝集素將病毒分為8個(gè)血清群，但僅有1個(gè)血清型[2]。目前我國(guó)流行毒株為基因Ⅱ型血清8 群[3]。

ASF潛伏期為4～19 d不等，潛伏期長(zhǎng)短主要取決于病毒毒力、宿主狀態(tài)及感染方式，高毒力毒株的致死率可達(dá)100%且各年齡段豬只都易感。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International des Epizooties，OIE）將ASF列為法定上報(bào)疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。Zhao等[3]用分離的Pig/HLJ/18毒株感染SPF豬，豬只出現(xiàn)發(fā)燒（超過(guò)41℃），食欲不振，嗜睡，耳緣、尾巴和四肢末端皮膚發(fā)紅，呼吸困難和嘔吐等癥狀，這與豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬丹毒、豬皮炎腎病綜合征等疾病的癥狀相似，難以從臨床癥狀直接判斷區(qū)分，需借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段來(lái)確診。ASF感染豬只的唾液、淚液、鼻腔分泌物、尿液、糞便等都可含有病毒，尤其血液中含有大量病毒，可采集相關(guān)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

ASFV對(duì)豬及豬產(chǎn)品、食品安全有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)影響，尤其是在以豬肉制品為主要蛋白質(zhì)來(lái)源的國(guó)家。1921年ASF被首次報(bào)道，之后主要流行于撒哈拉以南的非洲地區(qū)。2007年ASF在格魯吉亞暴發(fā)[4]，疫情迅速蔓延至整個(gè)高加索和俄羅斯地區(qū)。2014年ASF傳入東歐大部分國(guó)家并初步呈現(xiàn)出擴(kuò)大流行趨勢(shì)[5]。我國(guó)生豬養(yǎng)殖體量大，自2018年8月初首次報(bào)道非洲豬瘟疫情以來(lái)，截至2019年7月3日，我國(guó)共發(fā)生非洲豬瘟疫情143起，撲殺生豬116萬(wàn)余頭。ASF在周邊的蒙古、越南、柬埔寨、老撾、朝鮮、韓國(guó)等地均有發(fā)生，防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。由于病毒本身的復(fù)雜性及對(duì)毒力因子和相關(guān)保護(hù)基因的了解不足，暫無(wú)有效疫苗用于ASF防控，因此豬場(chǎng)生存需依賴嚴(yán)格的生物安全措施和準(zhǔn)確快速的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。本綜述從分子生物學(xué)和免疫學(xué)兩方面介紹了ASF檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展，以期為不同條件下檢測(cè)方法的選擇提供參考。

1 分子生物學(xué)檢測(cè)

分子生物學(xué)方法主要是檢測(cè)病毒核酸，核酸檢測(cè)是針對(duì)病原體本身采取的檢測(cè)方法，能作為診斷ASFV感染潛伏期、急性期或病程初期的有效手段。在ASFV最急性和急性感染中，豬通常在抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性前已死亡，因此抗體檢測(cè)更適用于亞急性和慢性感染豬只。常見(jiàn)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1，檢測(cè)人員可以根據(jù)臨床發(fā)病情況及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件來(lái)選擇不同的核酸檢測(cè)方法，如現(xiàn)場(chǎng)快速診斷可采用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，鑒別診斷可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）或熒光定量PCR。

1.1 普通PCR

PCR已成功應(yīng)用于豬樣品（血液、組織、口腔液等）和鈍緣軟蜱中ASFV基因組的檢測(cè)，病毒的核酸片段通過(guò)PCR指數(shù)級(jí)擴(kuò)增獲得足以檢測(cè)的量，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。Luo等[6]根據(jù)GenBank中所有ASFV毒株的VP72基因序列的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立PCR方法，分析檢測(cè)極限是每反應(yīng)60個(gè)核酸拷貝，同時(shí)與豬其他幾種重要病原無(wú)交叉反應(yīng)。當(dāng)檢測(cè)來(lái)自不同區(qū)域的4種基因型（Ⅰ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ）的14株ASFV毒株時(shí)，新的PCR方法比兩種OIE推薦的PCR方法更靈敏。新的PCR檢測(cè)從烏干達(dá)收集的62份臨床血樣，與基于超靈敏通用探針庫(kù)的熒光定量PCR表現(xiàn)出了很高的一致性（59/62）。相比于其他的抗原檢測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）和直接熒光抗體技術(shù)，PCR方法具有更高的敏感性和特異性。

表1 常用分子生物學(xué)檢測(cè)方法比較Table1 Comparison of frequently-used molecular biology detection technologies

1.2 熒光定量PCR（RT-PCR）

RT-PCR因其高敏感性和特異性，已開(kāi)發(fā)很多穩(wěn)定成熟的商業(yè)化產(chǎn)品，并在各專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。2019年6月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布了第二批非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑名單，包括26個(gè)單位的34種產(chǎn)品，其中80%以上都為熒光定量PCR類，引物和探針都是根據(jù)病毒基因組中高保守區(qū)域VP72設(shè)計(jì)。

ASF和豬瘟及其他高熱病僅從臨床癥狀上難以區(qū)分，多重?zé)晒舛縋CR能實(shí)現(xiàn)多種病原同時(shí)檢測(cè)，用于臨床疾病的鑒別診斷，縮減檢測(cè)成本。王建華等[7]根據(jù)ASFVCP530R基因、豬瘟病毒5'UTR基因和高致病性藍(lán)耳病NSP2基因，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物和Taq Man水解探針，建立了多重?zé)晒舛縋CR方法，并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。該方法對(duì)ASFV的最低檢出量為每微升61拷貝。有研究者將懸浮陣列系統(tǒng)、自動(dòng)電子微陣列分析、GenomeLab基因表達(dá)譜（GeXP）分析等方法與熒光PCR技術(shù)結(jié)合，能一次檢測(cè)7種豬常見(jiàn)病原，極大提高了檢測(cè)效率，但檢測(cè)的敏感性有待提高[8-10]。RT-PCR方法敏感性高，檢測(cè)過(guò)程中需規(guī)范操作，否則易出現(xiàn)污染，干擾檢測(cè)結(jié)果。

1.3 數(shù)字PCR

微滴數(shù)字PCR（ddPCR）是近年興起的一種新的絕對(duì)定量技術(shù)，通過(guò)極度稀釋實(shí)現(xiàn)理論上的單分子擴(kuò)增，然后利用PCR和泊松分布計(jì)算出樣品的原始濃度，ddPCR是繼普通PCR、RT-PCR之后的第三代PCR技術(shù)。

鄔旭龍等[11]針對(duì)ASFVK205R基因設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物和Taq Man探針，通過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了ASFV ddPCR檢測(cè)方法，該方法最低檢測(cè)限度可達(dá)到0.36拷貝，在20μL反應(yīng)體系中約為10拷貝/反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度是RT-PCR的10倍。原霖等[12]建立ddPCR方法的最低檢測(cè)限可達(dá)每微升0.8拷貝，敏感性高于RT-PCR方法。但目前ddPCR檢測(cè)成本較RT-PCR高。

1.4 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無(wú)需反復(fù)的熱循環(huán)和精密的儀器，只需要恒溫裝置（如水浴鍋）就能進(jìn)行快速高效的擴(kuò)增反應(yīng)。該技術(shù)自出現(xiàn)以來(lái)就得到了迅猛發(fā)展，有望成為未來(lái)檢測(cè)發(fā)展的新趨勢(shì)。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)ASFV操作簡(jiǎn)便，對(duì)檢測(cè)儀器的要求低，反應(yīng)時(shí)間短，有自身特有的優(yōu)勢(shì)，但因缺乏熱循環(huán)過(guò)程中變性、退火等程序，檢測(cè)過(guò)程中易出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此僅適用于田間疾病初步篩查，這在一定程度上限制了等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用。目前相關(guān)檢測(cè)試劑盒中酶的成本較高，單個(gè)樣品檢測(cè)費(fèi)用較普通熒光PCR高。

1.4.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP是Notomi等[13]于2000年首先提出的一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該法使用4條引物（外引物F3/B3、內(nèi)引物FIP/BIP）來(lái)識(shí)別6個(gè)特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)，以及鏈置換功能的Bst DNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。田純見(jiàn)等[14]利用ASFV高度保守的非結(jié)構(gòu)DNA聚合酶G1211R基因制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立實(shí)時(shí)熒光LAMP方法，以ASFV E70株病毒核酸為模板，LAMP檢測(cè)靈敏度達(dá)到21 pg。James等[15]針對(duì)ASFV拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因建立LAMP方法，分析靈敏度能達(dá)到330個(gè)基因組拷貝，并且能夠檢測(cè)多個(gè)ASFV的代表性分離株而不與CSFV交叉反應(yīng)。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染ASFV（馬拉維分離株）的豬只的血液和組織樣品顯示，LAMP測(cè)定和RT-PCR之間具有良好的一致性。除了使用瓊脂糖凝膠或RT-PCR機(jī)器檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物外，還可以使用新型側(cè)向流動(dòng)裝置檢測(cè)生物素和熒光素雙標(biāo)記的ASFV LAMP擴(kuò)增子。

1.4.2 重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)（Recombinaseaid amplification，RAA） RAA利用37℃恒溫，將從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白（Single- stranded DNA binding，SSB）的幫助下使模板 DNA解鏈，并在DNA聚合酶的作用下形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)[16]。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的第二批非洲豬瘟現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒名單中有兩款熒光RAA檢測(cè)試劑盒，分別來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所和廣州悅洋生物技術(shù)有限公司。其中前者的RAA檢測(cè)試劑盒采用凍干工藝，制備RAA酶混合干粉，從DNA快速提取到RAA快速檢測(cè)可在30 min內(nèi)完成。若陰性對(duì)照無(wú)Ct值且無(wú)擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性對(duì)照Ct值＜30有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，為有效結(jié)果；在結(jié)果有效的前提下，待檢樣品有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35，判定為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性；若Ct值＞39或無(wú)數(shù)值，則判為陰性；若35＜Ct值≤39，則為可疑樣品，需對(duì)樣品重新檢測(cè)，如仍為可疑，則判為陽(yáng)性，否則為陰性。目前已有RAA法檢測(cè)塞內(nèi)卡病毒、沙門菌、瘧原蟲(chóng)等的報(bào)道。

1.4.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA） RPA是一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其與RAA原理基本相似，但前者重組酶來(lái)自T4噬菌體，后者來(lái)源于細(xì)菌或真菌，各種酶共同作用取代普通PCR熱循環(huán)解鏈過(guò)程，從而大大縮短反應(yīng)時(shí)間。實(shí)時(shí)熒光RPA法結(jié)合一個(gè)便攜式的等溫?cái)U(kuò)增儀可在15 min內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)時(shí)間和便利性優(yōu)于傳統(tǒng)PCR法。目前已有用RPA法檢測(cè)A型流感病毒、水泡性口炎等的報(bào)道。Miao等[17]利用RPA方法擴(kuò)增ASFVp72基因，同時(shí)結(jié)合側(cè)流試紙檢測(cè)，敏感度為150拷貝/反應(yīng)，38℃下10 min即可完成檢測(cè)，對(duì)145個(gè)田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果完全吻合。哈登楚日亞等[18]也針對(duì)ASFVp72建立了實(shí)時(shí)熒光RPA方法，可檢測(cè)10個(gè)拷貝的DNA分子，與Miao等的方法相比靈敏度提高了10多倍。

1.4.4 交叉引物擴(kuò)增法（Cross-priming isothermal amplification，CPA） CPA是針對(duì)靶基因區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，引物尾端交叉互換序列，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。Fr?czyk等[19]針對(duì)P72基因，利用CPA擴(kuò)增豬血液中的ASFV，單個(gè)樣品中最低能檢測(cè)到7.2個(gè)拷貝，與官方通用探針文庫(kù)（UPL）實(shí)時(shí)PCR相比，具有相同的靈敏度。Gao等[20]建立了一種CPA-診斷試紙聯(lián)用方法，該研究基于p72基因設(shè)計(jì)引物及探針，兩個(gè)探針?lè)謩e標(biāo)記生物素和FITC。該方法最低檢測(cè)限為200拷貝，對(duì)45份非洲疫區(qū)臨床全血DNA樣品檢測(cè)的結(jié)果顯示，該方法與RT-PCR的符合率為 97.8 %（44/45）。

1.4.5 聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)（Polymerase crosslinking spiral reaction，PCLSR） PCLSR是一種等溫?cái)U(kuò)增的新技術(shù)，將傳統(tǒng)PCR或RT-PCR的優(yōu)勢(shì)與等溫?cái)U(kuò)增的的優(yōu)勢(shì)結(jié)合在一起。外部引物的5'-末端互補(bǔ)于α-拉特羅毒素的遠(yuǎn)端基因，可保護(hù)反應(yīng)的初始步驟。比較LAMP、CPA和PCLSR發(fā)現(xiàn)，PCLSR具有更高的診斷特異性。Wo?niakowski等[21]利用聚合酶交聯(lián)螺旋反應(yīng)，針對(duì)p72基因設(shè)計(jì)3種引物，在65℃下反應(yīng)產(chǎn)生交聯(lián)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。使用SYBR Green I染料進(jìn)行凝膠電泳，觀察PCLSR的結(jié)果，靈敏度達(dá)到每微升720拷貝。試驗(yàn)結(jié)果需將擴(kuò)增產(chǎn)物開(kāi)蓋后進(jìn)行凝膠電泳觀察，氣溶膠污染的可能性大，因此不適合基層實(shí)驗(yàn)室使用。

1.5 其他技術(shù)

隨著科技進(jìn)步，出現(xiàn)了很多新的檢測(cè)方法，如液態(tài)芯片技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等。Wang等[22]建立了一種液態(tài)芯片技術(shù)Luminex xMAP，設(shè)計(jì)針對(duì)病原體核酸的特異性探針與引物，將探針與熒光羧化微球偶聯(lián)，能同時(shí)檢測(cè)包括ASFV在內(nèi)的10種昆蟲(chóng)傳播的病原體，每個(gè)反應(yīng)能檢測(cè)到10個(gè)目標(biāo)基因拷貝。Biagetti等[23]使用生物傳感器檢測(cè)血液中的ASFV核酸，利用具有鎖定核酸核苷酸的單鏈DNA探針作為p72基因保守區(qū)域的互補(bǔ)識(shí)別元件，其能檢測(cè)每微升373～1058拷貝范圍內(nèi)的DNA，在此范圍內(nèi)該生物傳感器的檢測(cè)結(jié)果與OIE推薦的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果有極好的相關(guān)性。

要獲得檢測(cè)的時(shí)效性，養(yǎng)殖基地現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)很重要，因此研究者也在檢測(cè)儀器設(shè)備改進(jìn)、樣品處理調(diào)整等方面開(kāi)展研究，使其更適合于基層檢測(cè)要求。Liu等[24]開(kāi)發(fā)了一種雙重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，用于快速檢測(cè)和分析ASFV和CSFV，該測(cè)定在便攜式電池供電的PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行。張彩虹等[25]根據(jù)VP72基因序列建立ASFV的RT-PCR方法，采集的樣品無(wú)需提取核酸，可在60 min內(nèi)完成對(duì)樣品的檢測(cè)。便攜式熒光PCR儀和核酸免提取技術(shù)，為野外或現(xiàn)場(chǎng)的非洲豬瘟病毒快速檢測(cè)提供了一種切實(shí)可行的方法。

2 免疫學(xué)檢測(cè)

病毒入侵機(jī)體后，機(jī)體識(shí)別“自身”與“非己”抗原，針對(duì)“非己”抗原產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，ASF的自然感染潛伏期為4～19 d，在臨床癥狀出現(xiàn)2 d前，ASF感染動(dòng)物開(kāi)始散播大量病毒，ASFV散播因毒株不同而異。機(jī)體感染ASFV后約7～9 d血清轉(zhuǎn)陽(yáng)，抗體陽(yáng)性可持續(xù)終生，亞急性及慢性感染豬血液中的帶毒量隨著時(shí)間推移會(huì)逐漸降低，此時(shí)抗體檢測(cè)顯示出意義，豬場(chǎng)新引進(jìn)的種豬除核酸檢測(cè)陰性外還需抗體檢測(cè)陰性。常用的免疫學(xué)方法有紅細(xì)胞吸附反應(yīng)（Haemadsorption，HA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫層析試紙條法、免疫印跡試驗(yàn)（Immunoblotting，IB）等，各檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較見(jiàn)表2。

表2 ASFV免疫學(xué)檢測(cè)方法比較Table2 Comparison of ASFV immunology detection technologies

2.1 HA

HA即在體外培養(yǎng)時(shí)受ASFV感染的白細(xì)胞周圍吸附豬紅細(xì)胞，形成“玫瑰花環(huán)”，該法是ASFV特有的檢測(cè)技術(shù)。Rod rí guez等[26]研究發(fā)現(xiàn)，ASFV基因組內(nèi)一個(gè)開(kāi)放閱讀框EP402R編碼的多肽（該多肽有402個(gè)氨基酸殘基，與T細(xì)胞粘附受體CD2同源，EP402R的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在病毒復(fù)制的后期）直接參與血細(xì)胞吸附現(xiàn)象。將EP402R內(nèi)一段長(zhǎng)354 bp的片段破壞后，病毒的體外生長(zhǎng)速率不受影響，但血細(xì)胞吸附現(xiàn)象消失。由于HA的特異性和敏感性，該法可用來(lái)評(píng)估疑似暴發(fā)，特別是當(dāng)其他檢測(cè)為陰性時(shí)，應(yīng)該用HA方法進(jìn)行確診。需要注意的是，并非所有ASFV都能產(chǎn)生HA。HA因操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，目前僅在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

2.2 ELISA

ELISA是一種敏感、快速、實(shí)惠的檢測(cè)技術(shù)，尤其適合于流行病學(xué)調(diào)查、疫病監(jiān)測(cè)與凈化時(shí)的自動(dòng)化血清學(xué)檢測(cè)。因此，ELISA是目前非洲豬瘟大規(guī)模血清學(xué)研究最適用的方法，其包括抗原檢測(cè)和抗體檢測(cè)。

Vidal等[27]利用針對(duì)P72的單克隆抗體結(jié)合固相夾心ELISA以檢測(cè)豬樣品中的P72蛋白，能檢測(cè)的最低抗原濃度為0.05μg/mL，低于使用多克隆抗體獲得的0.6μg/mL檢測(cè)限。用該方法檢測(cè)全病毒顆粒的敏感性為2.3×102PFU/ mL。Gim é nez-lirola等[28]選定 p30 作為間接 ELISA中使用的重組蛋白，能夠檢測(cè)血清或口腔液樣本中的ASFV抗體。實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)豬只接種ASFV，8～12 d后采用優(yōu)化的ELISA方法可從采集的豬血清和口腔液樣品（血清樣品以1∶100稀釋，口腔液樣品以1∶2稀釋）中檢測(cè)到抗p30抗體。對(duì)非疫區(qū)豬群的血清（n= 200）和口腔液（n= 200）田間樣品的測(cè)試表明，該方法具有高度特異性。

然而，由于血清成分復(fù)雜及缺乏特異性試劑等原因?qū)е翬LISA經(jīng)常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，尤其當(dāng)樣品處理或保存不當(dāng)，如溶血樣品可能產(chǎn)生高達(dá)20%的假陽(yáng)性結(jié)果，故通過(guò)ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的可疑樣品須通過(guò)其他血清學(xué)替代試驗(yàn)確認(rèn)，如IB。

2.3 免疫層析試紙條法

免疫層析技術(shù)是一種固相免疫標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)靈敏迅速，結(jié)果判定直觀，無(wú)需特殊設(shè)備和專業(yè)人員等優(yōu)點(diǎn)。較經(jīng)典的即時(shí)檢測(cè)主要以膠體金作為標(biāo)記物，以檢測(cè)線和質(zhì)控線顯色情況及深淺進(jìn)行定性及半定量檢測(cè)，不能實(shí)現(xiàn)完全定量。吳海濤等[29]利用膠體金標(biāo)記的ASFV P72蛋白單克隆抗體包被硝酸纖維素膜，以識(shí)別兩種原核表達(dá)的P72蛋白，對(duì)兩種抗原的最低識(shí)別量分別為15、21 ng，經(jīng)測(cè)試該試紙條的特異性、敏感性、穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。張?chǎng)斡畹萚30]建立ASFV p54抗體的膠體金檢測(cè)方法，該試紙條的敏感性為200 ng/mL，可在5～10 min內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)141份豬血清樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)表明，在ASFV感染早期，膠體金試紙優(yōu)于OIE推薦的間接ELISA檢測(cè)方法；以Western Blot檢測(cè)方法作為參照，該試紙條檢測(cè)疫區(qū)陽(yáng)性樣品的符合率比ELISA高。Sastre等[31]開(kāi)發(fā)了用于抗原檢測(cè)的側(cè)向流動(dòng)測(cè)定（Lateral flow assay，LFA），將針對(duì)VP72蛋白的單克隆抗體與黑色乳膠珠共價(jià)結(jié)合，可在10 min內(nèi)判定結(jié)果。測(cè)定血液中抗體的靈敏度為3 ng，與市售的雙抗體夾心ELISA相當(dāng)。當(dāng)使用組織培養(yǎng)病毒進(jìn)行測(cè)試時(shí)，檢測(cè)限低至104PFU/mL。LFA的靈敏度低于RT-PCR，在檢測(cè)田間樣品時(shí)假陰性比例高。有研究者利用試紙條法實(shí)現(xiàn)多種病原抗體同時(shí)檢測(cè)，Sastre等[32]利用雙重側(cè)向流動(dòng)法，將VP72蛋白和CSFV的E2蛋白與不同顏色乳膠微球耦合，可同時(shí)檢測(cè)血液樣品中的ASFV和CSFV抗體。

新型試紙檢測(cè)技術(shù)向著多靶標(biāo)、高敏感性檢測(cè)等方向發(fā)展，出現(xiàn)用于提高試紙敏感性的新材料，如量子點(diǎn)、磁顆粒、熒光微球等。量子點(diǎn)又稱作納米晶，相對(duì)于傳統(tǒng)的有機(jī)染料，量子點(diǎn)標(biāo)記材料具有更好的光穩(wěn)定性、窄且對(duì)稱的發(fā)射光譜、高的發(fā)光強(qiáng)度及更長(zhǎng)的熒光壽命。林彥星等[33]將ASFV VP73蛋白的抗原性多肽作為試紙條檢測(cè)線的包被抗原，采用量子點(diǎn)作為標(biāo)記材料對(duì)葡萄球菌蛋白A（SPA）進(jìn)行標(biāo)記，以抗SPA的多克隆抗體作為質(zhì)控線的包被蛋白，制備快速檢測(cè)ASFV抗體的量子點(diǎn)免疫層析試紙條。結(jié)果表明，所制備的試紙條與常見(jiàn)相關(guān)豬疫病陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，與進(jìn)口ELISA試劑盒對(duì)臨床樣品的檢測(cè)符合率為100%。

試紙條法檢測(cè)結(jié)果容易受到樣品質(zhì)量的影響，如樣品來(lái)自死亡或者捕殺動(dòng)物的尸體，或血液樣品出現(xiàn)溶血等都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，因此試紙條法僅適用于檢測(cè)條件缺乏地區(qū)的ASF初步篩查。

2.4 IB

IB技術(shù)適用于蛋白質(zhì)檢測(cè)和鑒定。該技術(shù)快速、靈敏，其原理是抗原抗體的特異性結(jié)合，操作相對(duì)復(fù)雜，適合于專業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室使用。當(dāng)血清樣品疑似保存較差時(shí)推薦使用這種方法。ASFV感染動(dòng)物后會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多種病毒蛋白的抗體，可通過(guò)IB試驗(yàn)檢測(cè)到。Kazakova等[34]使用高度純化的重組p30蛋白開(kāi)發(fā)免疫印跡試驗(yàn)系統(tǒng)（Rec p30-IB），Rec p30-IB測(cè)試結(jié)果顯示，該方法的診斷特異性和靈敏度分別為98.75%和100.00%，可用于免疫系統(tǒng)器官樣本及血清中ASFV的特異性抗體檢測(cè)。

Alcaraz等[35]利用大腸桿菌表達(dá)p54蛋白建立了ASFV的IB檢測(cè)技術(shù)，證實(shí)ELISA檢測(cè)ASFV特異性抗體中獲得的陽(yáng)性結(jié)果。重組蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)是高度特異性的，并且對(duì)ASFV感染的豬只檢測(cè)同樣敏感，新的蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)消除了常規(guī)技術(shù)使用抗原中含細(xì)胞化合物產(chǎn)生的假陽(yáng)性反應(yīng)的可能性，并且避免了在抗原生產(chǎn)中使用活病毒。

3 討論

由于ASF尚無(wú)可用疫苗，ASFV抗體陽(yáng)性即表明現(xiàn)在或曾經(jīng)發(fā)生了感染。此外，ASFV抗體在感染早期即可出現(xiàn)并可持續(xù)數(shù)年。然而，在最急性和急性感染中，豬通常在抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性前已死亡。因此，在疫病暴發(fā)的早期階段，建議采集樣品檢測(cè)病毒核酸或抗原。但隨著一種疾病在某地的長(zhǎng)時(shí)間流行，亞急性感染和耐過(guò)豬只增多，此時(shí)抗體檢測(cè)顯示出意義。

1979—1981年巴西與伊比利半島有3.5%和0.6%的暴發(fā)案例源于ASFV感染后耐過(guò)轉(zhuǎn)為血清陽(yáng)性存活豬只帶毒傳播造成的[36-37]。近年西非坦桑尼亞3.72%豬只感染ASFV后呈現(xiàn)無(wú)癥狀但血清陽(yáng)性，并在1年后導(dǎo)致新的暴發(fā)[38]。我國(guó)非洲豬瘟的疫情史較短，目前流行的主要是強(qiáng)毒株，但非洲豬瘟短期內(nèi)在我國(guó)較難清除，巴西凈化非洲豬瘟所用時(shí)間最短也耗時(shí)7年。隨著病毒和宿主的相互適應(yīng)進(jìn)化，出現(xiàn)病毒毒力由強(qiáng)到弱也不無(wú)可能。在歐洲已有非洲豬瘟基因Ⅱ型病毒株由強(qiáng)毒力轉(zhuǎn)變?yōu)橹械榷玖Φ膱?bào)道[39]，這一轉(zhuǎn)變表明病毒的致死率降低，臨床癥狀更溫和，豬只出現(xiàn)耐受，長(zhǎng)時(shí)間后血液帶毒量低，而抗體能在豬體內(nèi)留存多年甚至可終生存在，檢測(cè)時(shí)效性更長(zhǎng)。未來(lái)ASFV疫苗面世后，也可利用抗體監(jiān)測(cè)來(lái)反映疫苗免疫效果。

為更好應(yīng)對(duì)非洲豬瘟疫情，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鼓勵(lì)各規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行自檢。目前RT-PCR檢測(cè)的靈敏度高，在各基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多。但由于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室未嚴(yán)格分區(qū)，專業(yè)檢測(cè)人員缺乏，容易發(fā)生實(shí)驗(yàn)室氣溶膠污染，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)或檢測(cè)中斷。ASFV檢測(cè)在基層的廣泛應(yīng)用依賴于對(duì)病原特性進(jìn)一步研究，尋找特異性好、靈敏度高且更適用于田間檢測(cè)的技術(shù)。ASF作為外來(lái)動(dòng)物疫病，使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)損失慘重，此次災(zāi)難也促進(jìn)各地豬場(chǎng)生物安全防控的全面升級(jí)改造，從控制傳染源、切斷傳播途徑、保護(hù)易感動(dòng)物等各方面來(lái)控制疫情傳播擴(kuò)散。我們需積極從ASF防控中吸取經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，采取系統(tǒng)化措施控制外來(lái)疫病，穩(wěn)定畜牧業(yè)生產(chǎn)。