30種中草藥對鱘魚源海豚鏈球菌的體外抑菌作用

姚 麗，董春燕，陳江鳳，黎 明，邵 儉，安 苗，王常安，王靜波，程振濤，姜海波,6，文 明

( 1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211； 4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070； 5.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176； 6.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025 )

鱘魚是現(xiàn)存起源最早的脊椎動物之一，隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、軟骨硬鱗總目、鱘形目。在全球的鱘形目種類中，自然分布在我國境內(nèi)的鱘魚種類共2科3屬8種，分別是新疆的西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)、小體鱘(A.ruthenus)和裸腹鱘(A.nudiventris)，長江水系和珠江水系的中華鱘(A.sinensis)，黑龍江水系的施氏鱘(A.schrenckii)和達(dá)氏鰉(Husodauricus)，長江水系的達(dá)氏鱘(A.dabryanus)和白鱘(Psephurusgladius)[1]。鱘魚是我國重要的冷水性經(jīng)濟(jì)魚類，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖產(chǎn)量迅猛增加，至2017年我國鱘魚產(chǎn)量已達(dá)83 058 t[2]。然而，疾病頻發(fā)卻成為影響鱘魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的最重要因素之一，尤其以細(xì)菌性疾病的危害最為嚴(yán)重。目前已報(bào)道的能夠誘發(fā)鱘魚細(xì)菌性疾病的主要致病菌有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[3-6]、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[7-8]、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[9]和海豚鏈球菌(S.iniae)[10]等。海豚鏈球菌屬芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，為革蘭氏陽性菌，廣泛分布于水環(huán)境、土壤和食物中。該菌感染宿主廣、致病力強(qiáng)，給水產(chǎn)、禽類以及人類健康帶來嚴(yán)重危害[11-12]。已有研究報(bào)道虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[13]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[12]、斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)[14]等養(yǎng)殖魚類感染海豚鏈球菌，并導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

使用化學(xué)消毒劑和抗生素類藥物防治魚類細(xì)菌性疾病是當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中的主要手段。但是長期使用此類藥物不僅破壞養(yǎng)殖水域環(huán)境，而且會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性、魚體藥物殘留超標(biāo)，進(jìn)而影響水產(chǎn)品的食用安全性[15-17]。中草藥具有來源廣泛、毒副作用小、殘留少、安全性高、無殘留和療效好等特點(diǎn)，因此利用中草藥防治魚類細(xì)菌性疾病備受關(guān)注[18-21]?，F(xiàn)有研究表明，黃連、黃芩、大黃、黃柏、博落回、五倍子和石榴皮等中草藥對羅非魚源海豚鏈球菌具有較強(qiáng)的抑菌效果[22-24]，但針對鱘魚源海豚鏈球菌尚未見報(bào)道。筆者選取黃連等30種中草藥，研究其對鱘魚源海豚鏈球菌的體外抑菌作用，以期為防治鱘魚源海豚鏈球菌誘發(fā)的疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

海豚鏈球菌為北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站分離鑒定和保存提供。

1.2 試驗(yàn)藥物

選取黃芩、黃連、金銀花、連翹、穿心蓮、山楂、生首烏、秦皮、射干、女貞子、豬苓、蒼術(shù)、蘇葉、黨參、茯苓、貫眾、竹柴胡、鳳尾草、薄荷、丹參、志遠(yuǎn)、苦楝皮、丁香、金櫻子、石榴皮、野菊花、忍冬藤、青蒿、桔梗和使君子30種具有廣譜抗菌及消炎功效的中草藥為研究對象，試驗(yàn)前將30種中草藥分別粉碎后過60目篩，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 中草藥藥液制備

取上述30種中草藥各20 g，分別注入300 mL雙蒸水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火熬制30 min，4層紗布過濾，收集濾液，重復(fù)3次，合并3次濾液，濃縮至20 mL(即質(zhì)量濃度1000 mg/mL)，經(jīng)4000 r/min離心30 min后裝瓶高壓滅菌，放涼后置冰箱4 ℃保存?zhèn)溆肹23]。

1.4 菌懸液的制備

取保藏菌種，接種血平板，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于TSB液體試管中進(jìn)行搖床培養(yǎng)24 h(28 ℃，140 r/min)，調(diào)整菌液密度為2×108～3×108cfu/mL，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 中草藥平板抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯法[23]，即在無菌條件下，用直徑9 cm培養(yǎng)皿，將其平均分成3個(gè)區(qū)域，分別在固定位置放入高(10±0.1) mm、外徑(8±0.1) mm、內(nèi)徑(6±0.1) mm的3只牛津杯內(nèi)，并排列呈正三邊形，保持相鄰兩孔的距離大于3 cm，以免相鄰的抑菌圈重疊而影響測量準(zhǔn)確性。待滅菌培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時(shí)倒平板(30 mL/個(gè))，放出部分水汽，放平，待其凝固后用無菌鑷子將牛津杯輕輕取出，留下3個(gè)大小一致的孔洞，并在底部的相應(yīng)位置作好記號，在每個(gè)平皿內(nèi)分別加入0.1 mL海豚鏈球菌菌液，用無菌玻璃涂布棒涂抹均勻，最后在孔洞里分別加入100 μL中草藥藥液，每個(gè)平皿中加1種藥液，每種藥液加3個(gè)平板孔作為平行樣，設(shè)置陽性對照(涂菌，打孔，加強(qiáng)力霉素)和空白對照(涂菌，打孔，加雙蒸餾水)，將平皿小心地平移至恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后分別觀察并測量抑菌圈直徑大小，每孔取不同方向測量2次，最終求取3個(gè)平板共6次測量結(jié)果的平均值，以代表該種藥液抑菌效果[25-26]。判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑0～10 mm為低度敏感，10～20 mm為中度敏感，>20 mm為高度敏感[24,27]。

1.6 中草藥最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度的測定

采用二倍稀釋法[15,28]，測定30種中草藥水溶性提取物的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度。具體操作如下：取13支滅菌帶棉塞的試管(15×150)進(jìn)行編號(1～13號)，首先在1～13號試管加入2.5 mL無菌液體培養(yǎng)基；其次在1號試管中加入2.5 mL原藥液混勻，隨后從1號中吸取2.5 mL加入2號試管，依次吸取2.5 mL混合液加入后面編號的各試管中直至11號試管，然后再從11號試管吸取2.5 mL丟棄；最后在1～11號試管中各加入100 μL菌液搖勻，12號試管加菌液不加藥液作為生長對照，13號試管加藥液不加菌液作空白對照。每種中草藥重復(fù)3次，于28 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)結(jié)束后觀察1～13號試管內(nèi)的細(xì)菌生長情況，其中無菌生長的最高稀釋質(zhì)量濃度即為最小抑菌質(zhì)量濃度。

在最小抑菌質(zhì)量濃度試驗(yàn)基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，清澈透明無混濁現(xiàn)象的試管即為無菌生長試管。無菌生長試管中的最低藥物質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥水提物的抑菌圈結(jié)果

中草藥提取物對致病菌海豚鏈球菌的抑菌直徑見表1。結(jié)果顯示，海豚鏈球菌對黃連、丁香、連翹和黃芩4種中草藥高度敏感，抑菌圈直徑依次為(28.35±0.65)、(23.63±3.38)、(23.53±1.93) mm和(22.96±2.01) mm；海豚鏈球菌對生首烏、豬苓、蒼術(shù)、茯苓、貫眾和丹參6種中草藥低度敏感，其抑菌直徑分別為(8.63±0.00)、(8.56±0.00)、(9.29±2.19)、(9.37±1.15)、(9.45±0.45) mm和(8.06±0.46) mm；海豚鏈球菌對剩余20種中草藥中度敏感。

2.2 中草藥的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度

30種中草藥對海豚鏈球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度結(jié)果見表2。黃連、黃芩、連翹和丁香4種高度敏感中草藥提取液對病原菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1.95、1.95、3.90 mg/mL和3.90 mg/mL，最小殺菌質(zhì)量濃度分別為3.90、15.62、7.81 mg/mL和15.62 mg/mL。秦皮雖然屬于中度敏感中草藥，但是其最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均較低且相同，為7.81 mg/mL。其余19種中度敏感中草藥最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度均大于15.62 mg/mL。低度敏感中草藥中僅貫眾可獲得最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度，分別為500 mg/mL和>500 mg/mL。

表1 30種中草藥對海豚鏈球菌的體外抑菌圈Tab.1 Antibacterial effects of 30 Chinese herbal medicines against S. iniae in vitro

注：“R”.低度敏感(0～10 mm); “I”.中度敏感(10～20 mm); “S”.高度敏感(>20 mm).表中數(shù)值為n=6平均值.

Note:“R”.low sensitivity (0～10 mm); “I”.moderately sensitive (10～20 mm); “S”.highly sensitive (>20 mm). The value in the table is the mean value(n=6).

表2 30種中草藥對海豚鏈球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度 mg/mLTab.2 Minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimal bactericidal concentrations (MBC) of Chinese herbal medicines against S. iniae

3 討 論

3.1 中草藥提取液的體外抑菌效果分析

本研究發(fā)現(xiàn)，鱘魚源海豚鏈球菌對黃連、黃芩、連翹和丁香4種中草藥水提取物高度敏感，其中黃連、黃芩的研究結(jié)果與針對羅非魚源海豚鏈球菌的研究報(bào)道一致。張彬等[23]證實(shí)，羅非魚源海豚鏈球菌對黃連和黃芩高度敏感。但張彬等[23]發(fā)現(xiàn)，羅非魚源海豚鏈球菌對連翹僅僅表現(xiàn)為中度敏感，體外抑菌圈直徑為(14.67±0.82) mm。在本研究中，連翹對鱘魚源海豚鏈球菌體外抑菌圈直徑達(dá)到(23.53±1.93) mm，表明鱘魚源海豚鏈球菌對連翹水提物高度敏感。而吳穎瑞等[22]認(rèn)為，羅非魚源海豚鏈球菌對黃連低度敏感，而黃芩、連翹對羅非魚海豚鏈球菌無抑菌效果。研究結(jié)果存在差異，這可能與供試菌株、供試藥液制備方法、供試藥液含量等方面不同有關(guān)。本研究中采取水煎煮法，配置的供試藥液質(zhì)量濃度為1000 mg/mL；張彬等[23]同樣采取水煎煮法，但是配置的藥液質(zhì)量濃度僅為480 mg/mL；吳穎瑞等[22]則采用95%乙醇回流提取，制備成浸膏狀，使用乙醇∶吐溫∶蒸餾水=1∶1∶8(體積比)的混合溶劑，配置成質(zhì)量濃度為1000 mg/mL的供試藥液。目前提取中草藥的方法分為傳統(tǒng)提取方法(煎煮法、浸漬法、回流法、滲漉法等)和新型提取方法(超臨界流體萃取法、酶法、半仿生—酶法等)。中草藥成分復(fù)雜，采取不同提取方法對中草藥有效成分的提取率不同，進(jìn)而表現(xiàn)為藥效不同[29]。

3.2 中草藥的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度差異及成分分析

張彬等[23-24]報(bào)道，黃連提取液對羅非魚源海豚鏈球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度分別為3.75 mg/mL和7.50 mg/mL，這與本研究結(jié)果極為相似。本研究中，黃連提取液對鱘魚源海豚鏈球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度最小，分別為1.95 mg/mL和3.90 mg/mL，表現(xiàn)出很好的抑菌、殺菌效果。中草藥的抑菌、殺菌效果與其含有的抗菌活性物質(zhì)有關(guān)[30]。黃連中富含黃連堿、小檗堿、巴馬汀等活性成分，通過破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)、抑制糖代謝達(dá)到抑菌的作用[31]。林媛等[32]證實(shí)，小檗堿對痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等細(xì)菌均表現(xiàn)出很好的抑菌效果，最小抑菌質(zhì)量濃度均小于100 μg/mL。本研究中，黃芩和連翹同樣表現(xiàn)出較好的抑菌、殺菌效果，黃芩的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度分別為1.95 mg/mL和15.62 mg/mL，連翹的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度分別為3.90 mg/mL和7.81 mg/mL。同樣，黃芩和連翹針對羅非魚源海豚鏈球菌也表現(xiàn)出較好的抑菌、殺菌效果，張彬等[24]報(bào)道，黃芩和連翹提取液對羅非魚源海豚鏈球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度相同，分別為7.50 mg/mL和15.00 mg/mL。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩中主要活性成分黃酮類化合物，可以通過阻礙細(xì)菌體內(nèi)的能量代謝途徑，實(shí)現(xiàn)廣譜抗菌作用[33]。連翹中含有抗菌活性的苯乙醇苷類化合物：6′-O-(順式-1，4-二羥基環(huán)己乙?；?-類葉升麻苷(1)；4-O-鼠李糖基-7S，8R-7′，8′-赤式—蒜芥茄脂素(2)；毛花球花苷A(3)；黃花馬纓丹苷 B(4)；石蠶苷B(5)；紫莖女貞苷J(rèn)(6)；厚樸苷F(7)；松果菊苷(8)；異厚葉車前苷(9)。其中化合物1、6、8對金黃色葡萄球菌(ATCC 33591)生長具有中等強(qiáng)度抑制作用，最小抑菌質(zhì)量濃度分別為8.00、16.00、4.00 μg/L，表現(xiàn)出消炎、抗病毒、抗氧化等多種藥理學(xué)作用[34]，這些藥理學(xué)作用與連翹的抗菌作用密切相關(guān)。目前尚未見關(guān)于丁香和秦皮對海豚鏈球菌抑菌、殺菌效果的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，上述兩種中草藥水提物表現(xiàn)出與連翹相似的抑菌、殺菌效果，這同樣與其含有的活性成分密切相關(guān)。付振喜[35]研究發(fā)現(xiàn)，丁香主要活性成分為丁香精油，具有廣譜抗菌作用，其對青霉(Penicillium)、腐霉(Pythium)、交鏈孢(Alternaria)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為3.125、1.56、6.25、6.25、3.125 μg/L，最小殺菌質(zhì)量濃度分別為3.125、3.125、6.25、6.25、6.25 μg/L?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，秦皮具有抗病原微生物、抗炎等作用，姚麗芳等[36-37]報(bào)道，秦皮對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。翁遠(yuǎn)超等[38]分析獲得，秦皮中主要已知化合物有16種，其中橄欖苦苷、plantainoside A、calceolariolside A、calceolariolside B和hydroxyframoside A對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有體外抑菌活性，且體外對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為512、64、256、128、512 mg/L。此外，供試中草藥的產(chǎn)地、藥用部位、煎煮方法、采集季節(jié)、植物年齡、貯藏及炮制方法等因素也是影響中草藥藥效的重要因素[23]。

本研究證實(shí)，黃連、黃芩、連翹、丁香和秦皮對鱘魚源海豚鏈球菌均具有較好的抑菌、殺菌功效，其中以黃連功效最佳。但其對病原菌的抑菌機(jī)理目前尚未明確，有待于進(jìn)一步證實(shí)，同時(shí)其實(shí)際臨床應(yīng)用療效有待于進(jìn)一步通過動物體內(nèi)試驗(yàn)加以比較、驗(yàn)證。