蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2在商品化釀酒酵母中的高水平表面展示

孫 大 禹， 周 海 龍， 杜 元 元， 李 憲 臻， 楊 帆

( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034；2.中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會， 北京 100833 )

0 引 言

菊糖是由多個D-呋喃果糖分子通過β-2,1-糖苷鍵連接而成的果糖聚合物，呈直鏈結(jié)構(gòu)，其還原末端通過α-1,2糖苷鍵連有一個葡萄糖殘基[1]。菊糖的聚合度一般在2～60，平均聚合度為10，水解后可生成少量葡萄糖和果糖[2-3]。菊糖作為貯存性果聚糖類碳水化合物，廣泛存在于菊芋等植物中[4]。菊芋在我國的畝產(chǎn)可達3～5 t，是生產(chǎn)燃料乙醇的優(yōu)質(zhì)能源生物質(zhì)[5]。

研究表明，僅有少數(shù)微生物能夠直接利用菊糖生產(chǎn)乙醇，且其乙醇生產(chǎn)能力十分有限[6]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為生產(chǎn)乙醇的傳統(tǒng)菌株，其乙醇生產(chǎn)能力強、易于培養(yǎng)且遺傳操作平臺成熟，成為轉(zhuǎn)化菊糖產(chǎn)乙醇的首選微生物[7]。然而，絕大多數(shù)天然釀酒酵母菌株都不能有效將菊糖水解為可發(fā)酵糖[8]，嚴重阻礙了菊糖基乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)進程。研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母KCCM50549在5 L發(fā)酵罐中，利用180 g/L菊芋粉(菊糖聚合度小于15)生產(chǎn)乙醇時的乙醇產(chǎn)量為36.2 g/L[9]。中科院青島生物能源研究所微生物資源團隊獲得了一株溫度耐受性菊糖代謝釀酒酵母菌株，該菌株在40 ℃下乙醇得率為79.7%，這是目前報道的非工程釀酒酵母中菊芋乙醇發(fā)酵的最高得率。

作為釀酒酵母水解菊糖的關鍵酶，蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的表達水平直接影響釀酒酵母水解菊糖的能力[10]。本工作克隆獲得釀酒酵母蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的編碼基因，并利用AGA1-AGA2錨定蛋白復合體將SUC2表面展示于商品化釀酒酵母菌株EBY100中，旨在為理性改造釀酒酵母使其高效轉(zhuǎn)化菊糖產(chǎn)乙醇提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

S.cerevisiaeEBY100及酵母表面展示載體pYD1，美國英杰生命技術(shù)有限公司；E. coli DH10B及pMD18-T Simple Vector獲贈于大連化學物理研究所趙宗保研究員課題組。釀酒酵母BY-BS是含有質(zhì)粒pYC230-SUC2的釀酒酵母BY4741重組菌株，由本室前期構(gòu)建并保藏。

PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，250 bp DNA Marker，大連寶生物有限公司；DpnⅠ，NEB公司。

酵母發(fā)酵液體培養(yǎng)基YPD：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 6.0；固體YPD培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同YPD液體培養(yǎng)基；YNB-CAA液體培養(yǎng)基：YNB 6.7 g/L，酪蛋白氨基酸5 g/L，葡萄糖或半乳糖20 g/L；LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同LB液體培養(yǎng)基。

Eppendorf AG22331電擊融合儀，德國艾本德股份有限公司；MD spectramax paradigm酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計

蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因SUC2的克隆及表達載體的構(gòu)建、鑒定所用引物均合成于大連寶生物有限公司，引物序列及功能如表1所示。

1.2.2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因的克隆

取搖床培養(yǎng)24 h的釀酒酵母新鮮發(fā)酵菌液，于4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體，采用基因組抽提試劑盒提取基因組DNA并以之為模板進行蔗糖轉(zhuǎn)化酶全長編碼基因的擴增?；驍U增上游引物為SUC2-F，下游引物為SUC2-R。PCR反應體系：100 ng釀酒酵母基因組DNA，10 μL 5×PrimeSTAR buffer，20 μmol/L引物，2.5 mmol/L dNTPs，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加水至總體積為50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收擴增產(chǎn)物。將回收的SUC2基因片段通過TA克隆連接至pMD18-T，構(gòu)建質(zhì)粒pT-SUC2并進行測序。

表1 SUC2引物序列及功能

1.2.3 pYD1-SUC2表面展示載體的構(gòu)建

采用RF克隆策略(Restriction-free cloning)將SUC2基因連接到表面展示載體pYD1上。RF I反應所用引物為pYD-SF和pYD-SR，以質(zhì)粒pT-SUC2為模板，反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應?；厥赵噭┖袑FI擴增產(chǎn)物進行回收。RF Ⅱ反應體系：280 ng RF Ⅰ回收產(chǎn)物，100 ng pYD1，5 μL 5×PrimeSTAR buffer，2.5 mmol/L dNTPs，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加水至總體積為25 μL。RF Ⅱ反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，15個循環(huán)(每個循環(huán)退火溫度降低1℃)，隨后，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，20個循環(huán)，68 ℃ 15 min，4 ℃結(jié)束反應。

取8.5 μL RF Ⅱ反應產(chǎn)物，加入1.5 μL 10 U/μLDpnⅠ，37 ℃消化6 h以上降解模板質(zhì)粒。取3 μL消化產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B中，轉(zhuǎn)化菌液涂布于含終濃度100 μg /mL氨芐青霉素的LB平板，挑選陽性克隆進行酶切驗證。酶切體系：0.5 μg質(zhì)粒DNA，0.5 μLXbaⅠ，1 μL 0.1%×BSA，1 μL 10×M buffer，加水至體積為10 μL，37 ℃溫育2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分析。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送至上海生工測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pYD1-SUC2。

1.2.4 表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的重組釀酒酵母的構(gòu)建

將鑒定正確表達質(zhì)粒pYD1-SUC2電擊轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeEBY100感受態(tài)細胞中，電壓為1.5 kV。電擊結(jié)束后轉(zhuǎn)化菌液加入1 mL山梨醇(1 mol/L)，30 ℃溫育2 h后將轉(zhuǎn)化菌液涂布于色氨酸選擇性篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒DNA并進行PCR鑒定，正確的重組釀酒酵母命名為EBY-S。

1.2.5 表面展示有SUC2的釀酒酵母重組菌株酶活測定

重組菌EBY-S在YNB-CAA液體培養(yǎng)基中于20 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)96 h。不同時間點取樣測定菌體表面展示SUC2的蔗糖酶活和菊糖酶活。酶活測定方法：1 mL發(fā)酵菌液5 000g、4 ℃ 離心10 min收集菌體，重懸于1 mL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH 6.8)。取50 μL重懸菌液與450 μL菊糖或蔗糖底物(20 g/L，pH 5.0)混勻，50 ℃水浴反應15 min。采用DNS法測定反應釋放的還原糖。菊糖酶及蔗糖酶酶活定義：在pH 5.0、50 ℃的反應條件下，每分鐘水解菊糖或蔗糖釋放1 μmol葡萄糖或果糖所需的酶量為1 U。對照菌株分別為本實驗室前期構(gòu)建的SUC2分泌表達菌株BY-BS和含有空pYD1載體的釀酒酵母EBY-C。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因SUC2的克隆

以釀酒酵母基因組DNA為模板，PCR擴增蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因SUC2，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。在1 500 bp附近擴增出一條特異性條帶，大小與蔗糖轉(zhuǎn)化酶目的基因片段一致。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對證明為蔗糖轉(zhuǎn)化酶的編碼基因，大小為1 592 bp，該基因編碼的蔗糖轉(zhuǎn)化酶含有533個氨基酸殘基，理論分子質(zhì)量為60.6 ku。該蔗糖轉(zhuǎn)化酶的N端含有一段大小為20 aa的分泌信號肽，其催化結(jié)構(gòu)域隸屬于糖苷水解酶32c家族。

1， SUC2基因目的條帶；M， DNA marker

2.2 SUC2表面展示表達載體及菌株的構(gòu)建

利用RF克隆策略將SUC2基因連接到表面展示載體pYD1上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B感受態(tài)細胞中。挑取陽性克隆進行質(zhì)粒提取，XbaⅠ酶切驗證。電泳結(jié)果如圖2所示，1號重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后顯示有大小為1 800和4 700 bp的兩條特異性條帶，與預測正確重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果基本一致。將酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送上海生工測序，結(jié)果表明本工作成功構(gòu)建了蔗糖轉(zhuǎn)化酶表達載體pYD1-SUC2。將表達載體pYD1-SUC2轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeEBY100感受態(tài)細胞中，30 ℃靜置培養(yǎng)，挑取陽性克隆提取重組質(zhì)粒并進行PCR鑒定。電泳結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后顯示有大小為1 800 bp的特異性條帶，與理論PCR結(jié)果基本一致。該結(jié)果表明，成功構(gòu)建了表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶的重組釀酒酵母EBY-S。

1， 重組質(zhì)粒酶切條帶； 1′， 重組質(zhì)粒； M， DNA marker

圖2 重組質(zhì)粒pYD1-SUC2的XbaⅠ酶切驗證結(jié)果

Fig.2 The electrophoresis results of the recombinant plasmid pYD1-SUC2 digested byXbaⅠ

1， PCR鑒定結(jié)果； M， DNA marker

圖3 轉(zhuǎn)化有pYD1-SUC2的釀酒酵母重組菌株EBY-S的鑒定結(jié)果

Fig.3 PCR identification of EBY-S transformed with pYD1-SUC2

2.3 表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的釀酒酵母重組菌株最佳產(chǎn)酶時間的確定

將表面展示蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2的釀酒酵母重組菌EBY-S在含有2%半乳糖的YNB-CAA液體培養(yǎng)基中誘導表達96 h，每12 h取樣，結(jié)果如圖4所示。隨著發(fā)酵時間的延長，細胞表面逐漸展示出蔗糖酶活力，72 h達到最高值241.6 U/mL，之后發(fā)酵菌液細胞表面SUC2酶活力逐漸下降。因此，EBY-S重組菌表面展示SUC2的最佳發(fā)酵時間為72 h。

圖4 重組菌株EBY-S蔗糖酶的最佳發(fā)酵時間

2.4 表面展示SUC2的釀酒酵母重組菌株酶活力分析

如圖5所示，在最適發(fā)酵時間條件下，EBY-S重組菌菌體表面展示SUC2的蔗糖酶酶活力為241.6 U/mL，菊糖酶酶活力為9.4 U/mL，顯著高于陰性對照菌株EBY-C。說明SUC2能夠借助錨定蛋白復合體AGA1-AGA2在EBY-100細胞表面成功展示表達。

圖5 SUC2釀酒酵母重組菌株酶活力分析

潘志友等[11]將脂肪酶B表面展示于釀酒酵母，產(chǎn)物乙酸乙酯的產(chǎn)率提高到98%。唐語謙等[12]將人源蛋白酶體α亞基6(α6)成功地展示于釀酒酵母中，結(jié)果顯示人源蛋白酶體α亞基6(α6)有很好的抗原性和特異性。本課題組前期工作中，將SUC2分泌表達在釀酒酵母BY4741中，獲得重組菌株發(fā)酵液上清的蔗糖酶及菊糖酶活力分別為100和5 U/mL[10]。本實驗中，當SUC2成功的展示于釀酒酵母上后，EBY-S重組菌菌體表面蔗糖酶活力是BY-BS的2.4倍，菊糖酶活力是BY-BS的1.9倍。結(jié)果表明，較之分泌表達技術(shù)，表面展示技術(shù)能夠顯著的提高酶在釀酒酵母中的酶活力。

3 結(jié) 論

本工作以釀酒酵母為出發(fā)菌株，從中克隆出蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC2編碼基因，并通過融合錨定蛋白AGA2實現(xiàn)其在釀酒酵母細胞表面的展示表達。重組菌在發(fā)酵72 h時，SUC2能夠通過錨定蛋白復合體AGA1-AGA2成功地表面展示于釀酒酵母細胞壁，且相對其他發(fā)酵時間表現(xiàn)出最高的表面展示水平，酶活力達241.6 U/mL。同時，相對于SUC2分泌表達型重組菌，SUC2表面展示菌株具有更高的蔗糖酶活力及菊糖酶活力。說明釀酒酵母表面展示系統(tǒng)對于提高菌株SUC2表達水平及酶活力具有很好的效果。