手性含氮飽和雜環(huán)醇的化學(xué)法與生物酶法合成

應(yīng)向賢，范雅君，黃美娟，汪 釗

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

引言

許多天然或非天然生物活性物質(zhì)中均含有含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)單元，在含氮雜環(huán)上引入手性羥基（尤其是3位羥基）對生物活性有重要影響。手性含氮飽和雜環(huán)醇具有活潑的官能團(tuán)“-OH”和“-NH-”，是合成醫(yī)藥、農(nóng)藥、獸藥和其他生物活性物質(zhì)的重要手性切塊，例如，(S)-N-Boc-3-哌啶醇可以合成非天然藥物卡普瑞林，或者天然生物活性物質(zhì)異白刺啉淋胺和小果白刺堿[1]；(R)-N-芐基-3-哌啶醇通過一步酯化可合成第二代二氫吡啶類鈣拮抗藥貝尼地平。手性含氮飽和雜環(huán)醇也可作為手性助劑用于其他手性物質(zhì)的合成，如以(R)-3-哌啶醇作為手性助劑可以合成手性α-羥基醛[2]。

化學(xué)法是工業(yè)上合成手性含氮飽和雜環(huán)醇的常用方法，包括動(dòng)力學(xué)拆分和不對稱還原。為了克服化學(xué)催化中的難點(diǎn)，人們一直在不斷探索新的生產(chǎn)方法。生物催化具有環(huán)境友好、反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，尤為研究者所重視。本文以哌啶醇、奎寧醇及吡咯烷醇的手性合成為例，闡述了化學(xué)催化和生物催化在合成手性含氮飽和雜環(huán)醇上的研究進(jìn)展。

1 手性哌啶醇

3-哌啶醇是許多藥物分子的生物活性結(jié)構(gòu)，如新型廣譜抗球蟲藥常山酮、抗癌新藥依魯替尼和抗高血壓藥物貝尼地平。由于哌啶環(huán)上的氨基較為活潑，手性哌啶醇的N往往帶有保護(hù)基團(tuán)。在手性哌啶醇中，對(S)-N-Boc-3-哌啶醇的研究最為多見。(S)-N-Boc-3-哌啶醇化學(xué)名稱為 (S)-1-叔丁氧羰基-3-哌啶醇，分子量201.2628 ，熔點(diǎn) 65～67 °C，CAS 號 143900-44-1。

此外，具有氮雜糖結(jié)構(gòu)的多羥基哌啶類衍生物是治療病毒感染（包括AIDS）、癌癥和糖尿病的重要藥物之一。

1.1 化學(xué)法合成手性哌啶醇

在化學(xué)合成中，可以從不同的起始原料合成手性3-哌啶醇。2001年Amat等人[3]先將N-芐基甘氨醇-四氫吡啶酮經(jīng)間氯苯氧甲酸雙鍵環(huán)氧化生成飽和二環(huán)羥基內(nèi)酰胺，最后經(jīng)硼烷四氫呋喃、氫氧化鈀碳、二碳酸二叔丁酯等試劑作用下催化得 (S)-N-Boc-3-哌啶醇，產(chǎn)物總得率低，僅為7.66%。2007年Reddy等人[4]以4-甲基溴苯乙酮為原料，經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)后生成(S)-N-Boc-3-哌啶醇，該合成方法產(chǎn)物總得率僅為31.1%，反應(yīng)過程繁瑣、耗時(shí)長。2010年劉前以3-吡啶醇為原料，與溴化芐反應(yīng)生成N-芐基-3-吡啶醇的季銨鹽，再用鎳基催化劑在3～5 atm氫氣壓力下催化還原得N-芐基-3-哌啶醇，產(chǎn)物收率達(dá)79%，純度＞99%。這是目前合成N-烷基取代的哌啶類衍生物最為直接的路線，然而該方法的產(chǎn)物為消旋哌啶醇，還需要輔以手性拆分才能獲得手性哌啶醇。2013年沈偉藝等人同樣以3-吡啶醇(1)為原料，經(jīng)5%銠炭催化加氫還原得消旋3-哌啶醇(2)，3-哌啶醇(2)經(jīng)D-酒石酸衍生物(2S,3S)-N-(4-氯苯基)-2,3-二羥基丁酰胺酸(3)拆分，再在三乙胺作用下與二碳酸二叔丁酯 “一鍋法”反應(yīng)制得 (S)-NBoc-3-哌啶醇，總收率約為40%，合成路線如圖1。

圖1 (S)-N-Boc-3-哌啶醇(5)的合成路線

1.2 生物酶法合成手性3-哌啶醇

與化學(xué)法相比，對于生物法合成手性哌啶醇的研究為時(shí)尚短。研究者以羰基還原酶作為生物催化劑不對稱還原哌啶酮生成手性哌啶醇，取得了較好的效果。2009年Lacheretz等人[5]利用胡蘿卜整細(xì)胞不對稱還原不同N-烷基取代的3-哌啶酮合成手性哌啶醇，其中對N-Boc-3-哌啶酮的催化效果最佳，得率73%，對映體過量值（e.e.值）為95%，但添加的底物濃度低（僅為2 mmol/L），且催化劑用量高達(dá)底物量的23%，尚不具備實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。2014年Ju Xin等人[6]從重組酶庫中篩選獲得對N-Boc-3-哌啶酮有活力的重組酶粉，以異丙醇為輔底物構(gòu)建輔酶循環(huán)體系，催化初始濃度為5%的N-Boc-3-哌啶酮不對稱還原，反應(yīng)24 h后，反應(yīng)得率為99.8%，e.e.值達(dá)93%。該哌啶酮還原酶催化特性與理想的生物催化劑還有一定差距，在工業(yè)催化上要求催化劑能同時(shí)滿足如下要求：底物濃度＞100 g/L，催化劑用量＜5 g/L，反應(yīng)時(shí)間＜24 h，轉(zhuǎn)化率＞98%以及 e.e.值＞99%[7]。 因此，生物酶法在不對稱合成手性哌啶醇上的應(yīng)用仍需要更高效的生物催化劑。

2 手性奎寧醇

對手性奎寧醇合成的研究多集中于(R)-3-奎寧醇。(R)-3-奎寧醇化學(xué)名稱為(R)-(-)-1-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛-3-醇，分子量 127.18，CAS號 25333-42-0。(R)-3-奎寧醇是毒蕈堿受體拮抗劑類藥物的前體，可用于他沙利定、瑞伐托酯、索利那新、阿地溴銨等藥物的合成[6]。

2.1 化學(xué)法合成手性奎寧醇

化學(xué)法合成 (R)-3-奎寧醇包括外消旋3-奎寧醇的選擇性拆分和3-奎寧酮的不對稱還原等方法。2009年李書彬等人[8]以硼氫化鉀為還原劑，將3-奎寧酮還原為外消旋的3-奎寧醇，再用D-(+)-二苯甲酰酒石酸進(jìn)行拆分，得到 (R)-3-奎寧醇，產(chǎn)物得率僅為20.4%，e.e.值98%。2009年Tsutsumi等人[9]使 用 RuBr2(xylskewphos)-(pica)金 屬催化劑不對稱氫化還原3-奎寧酮生成 (R)-3-奎寧醇，在4.3 kg反應(yīng)體系中產(chǎn)物e.e.值可達(dá)87%。2010年該課題組對金屬催化劑進(jìn)行了改進(jìn)，產(chǎn)物e.e.值提高至98%。2012年任彥榮采用CBS手性催化劑一步得到(R)-3-奎寧醇，e.e.值＞98%，收率達(dá)92%，步驟簡單，合成路線如圖2。

2.2 生物酶法合成手性奎寧醇

圖2 (R)-3-奎寧環(huán)醇(3)的合成路線

生物法利用奎寧酮還原酶不對稱還原奎寧酮生成(R)-3-奎寧醇，相關(guān)研究集中于高效奎寧酮還原酶的發(fā)現(xiàn)以及高效輔酶循環(huán)系統(tǒng)的構(gòu)建。2009年Uzura等人[10]從Rhodotorula rubra JCM3782中克隆得到一個(gè)NADPH依賴的3-奎寧酮還原酶基因，在大腸桿菌中與葡萄糖脫氫酶基因共表達(dá)，以凍干菌體作催化劑，在3-奎寧酮初始濃度618 mmol/L下反應(yīng) 2 h，產(chǎn)率達(dá) 98.6%，e.e.值＞99.9%。但是該酶對底物的親和力低，Km值高達(dá)145 mmol/L。 2012年 Isotani等人[11]從 Microbacterium luteolum JCM 9174分離得到兩個(gè)NADH依賴的還原酶QNR和bacC，并應(yīng)用于不對稱還原合成光學(xué)純的(R)-3-奎寧醇。該酶法催化體系利用來自Leifsonia sp.的醇脫氫酶（LSADH）構(gòu)建酶法偶聯(lián)輔酶循環(huán)體系，并以異丙醇做第二底物。將含有重組bacC的大腸桿菌重組菌與含有LSADH的大腸桿菌重組菌用聚乙烯亞胺和戊二醛進(jìn)行固定化并作為生物催化劑，隔8 h分批補(bǔ)料添加底物3-奎寧酮至10%（W/V），異丙醇至15%（V/V），48 h內(nèi)能夠完全轉(zhuǎn)化 939 mmol/L 3-奎寧酮，產(chǎn)物e.e.值＞99.9%。2012年Wang Yu等人[12]從土壤中篩選到兩株菌Nocardia sp.WY1202和Rhodococcus erythropolis WY1406，能夠分別不對稱還原奎寧酮生成光學(xué)純的(R)-和(S)-3-奎寧醇。當(dāng)?shù)孜餄舛龋?00 mmol/L時(shí)，野生菌整細(xì)胞催化得率下降，而e.e.值仍然為＞99%。2013年許建和等人報(bào)道了(R)-3-奎寧醇的酶法不對稱合成工藝，在該工藝中底物奎寧酮濃度為242 g/L，催化劑用量為5 g/L，反應(yīng)時(shí)間10 h，轉(zhuǎn)化率和e.e.值均大于99%，時(shí)空得率更是高達(dá)916 g/(L·d)[7]，該工藝是迄今為止生物酶法合成(R)-3-奎寧醇的最高水平。盡管在生物酶法合成(R)-3-奎寧醇已經(jīng)取得了可應(yīng)用于工業(yè)催化的成果，研究者們?nèi)匀恢铝τ诎l(fā)現(xiàn)新的奎寧酮還原酶。2014年Kolet等人[13]從30多株真菌中分離得到一株毛霉菌Mucor piriformis，該菌可以不對稱還原底物生成（R)-3-奎寧醇，但是效果不佳，底物濃度低，反應(yīng)時(shí)間長，e.e.值為 96%。

3 手性吡咯烷醇

在手性吡咯烷醇的合成方面，報(bào)道較多的是(S)-N-芐基-3-吡咯烷醇。(S)-N-芐基-3-吡咯烷醇的分子量177.24，CAS號101385-90-4。(S)-N-芐基-3-吡咯烷醇是合成治療膀胱過度活動(dòng)癥的藥物達(dá)非那新和抗高血壓藥物巴尼地平的關(guān)鍵中間體。

3.1 化學(xué)法合成手性吡咯烷醇

3-吡咯烷酮是合成天然抗腫瘤藥物喜樹堿的重要中間體，也是合成手性吡咯烷醇的前體，通過對3-吡咯烷酮的不對稱還原可以得到手性3-吡咯烷醇。2002年韓小兵等人[14]以價(jià)廉易得的甘氨酸作為起始原料，與丙烯腈加成后，經(jīng)水解酯化、酰化、成環(huán)、脫羧等5步反應(yīng)合成了3-吡咯烷酮鹽酸鹽，總收率達(dá)到51.1%。此外，研究者也可以利用手性原料直接合成手性吡咯烷醇。2010年劉前等人[15]以L-蘋果酸為手性原料，與乙酰氯反應(yīng)生成(S)-2-乙酰基蘋果酸酐，再與芐胺環(huán)合，經(jīng)酯交換反應(yīng)脫去乙?；?，再用三氟化硼-硼氫化鈉還原化合物得(S)-N-芐基-3-吡咯烷醇，總收率為59%。2012年魏林等人的合成路線更為簡單，將L-蘋果酸與芐胺經(jīng)無溶劑熔融反應(yīng)縮合得到酰亞胺 (S)-N-芐基-3-羥基吡咯烷-2,5-二酮(1)，改用價(jià)格低廉、安全穩(wěn)定的硼氫化鈉在碘催化下還原得到(S)-N-芐基-3-羥基吡咯烷-硼烷復(fù)合物(2)，最后再甲醇作用下脫去硼烷得到(S)-N-芐基-3-吡咯烷醇(3)。合成路線如圖3。

圖3 (S)-N-芐基-3-吡咯烷醇(3)的合成路線

3.2 生物酶法合成手性吡咯烷醇

生物法合成3-吡咯烷醇包括脂肪酶催化的選擇性拆分、單加氧酶催化的選擇性羥基化以及羰基還原酶催化的不對稱還原等方法。將酮底物經(jīng)硼氫化鈉還原為醇產(chǎn)物，醇經(jīng)酰化后再用脂肪酶選擇性拆分得到手性醇。脂肪酶催化的選擇性拆分理論產(chǎn)率僅為50%，并且過程中涉及化學(xué)加氫還原及產(chǎn)物衍生化，相較而言氧化還原酶催化的不對稱合成具有更大的優(yōu)勢。2010年Zhang Wei等人[16]克隆表達(dá)了來自于鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.HXN-200中的單加氧酶基因，該酶具有良好的區(qū)域及立體選擇性，可以將N-Cbz-3-吡咯烷酮直接羥基化生成光學(xué)純的 (R)-NCbz-3-吡咯烷醇。與單加氧酶催化的選擇性羥基化反應(yīng)相比，利用羰基還原酶催化的不對稱還原合成手性3-吡咯烷醇報(bào)道更多。2002年Itoh等人[17]從一株棒狀桿菌Corynebacterium sp.ST-10中分離得到一個(gè)NADH依賴的中鏈醇脫氫酶PAR，該酶底物譜廣、立體選擇性專一，能夠在24 h內(nèi)轉(zhuǎn)化5%濃度的N-Boc-3-吡咯烷酮，產(chǎn)物得率達(dá)85%，e.e.值＞99%。2005年，同課題組通過組合回復(fù)突變改造該酶，其突變體PAR268可以在5%～25%異丙醇存在下將底物完全轉(zhuǎn)化，顯著地提高了酶的溶劑耐受性，從而提高了底物轉(zhuǎn)化率[18]。2007 年 Yamada-Onodera 等人[19]從頭狀地霉菌Geotrichum capitatum JCM 3908中克隆得到一個(gè)NADH依賴的N-Boc-3-吡咯烷酮還原酶，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后該酶比活力為0.56 U/mg。將含有該吡咯烷酮還原酶的大腸桿菌重組菌與表達(dá)了葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌重組菌混合進(jìn)行整細(xì)胞催化，在不添加NADH情況下，1 h內(nèi)可將30 mmol/L底物完全轉(zhuǎn)化生成S構(gòu)型的醇，e.e.值＞99.9%。2008年Kizaki等人首次報(bào)道了可以合成光學(xué)純的(R)-N-芐基-3-吡咯烷醇的短鏈醇脫氫酶。該酶來自于核黃素德沃斯氏菌Devosia riboflavina KNK10702，純酶活力不高，僅為3.12 U/mg。目前生物法合成手性3-吡咯烷醇尚達(dá)不到工業(yè)應(yīng)用水平。

4 小結(jié)與展望

手性含氮飽和雜環(huán)醇是一類重要的藥物中間體，可以通過化學(xué)法和生物法合成。化學(xué)法可以利用廉價(jià)易得的原料合成含氮雜環(huán)酮，再通過前體酮的不對稱氫化得到手性含氮飽和雜環(huán)醇，也可以利用手性原料通過多步反應(yīng)直接合成手性含氮飽和雜環(huán)醇?；瘜W(xué)催化的反應(yīng)適用于高底物濃度，反應(yīng)速率和產(chǎn)物得率均較高。然而，在化學(xué)法中前體酮的氫化生成手性醇需要在加溫、加壓設(shè)備中進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)備要求和生產(chǎn)能耗高，反應(yīng)過程具有一定的危險(xiǎn)性。此外，化學(xué)法在手性催化中立體選擇性較低，或者使用的重金屬催化劑銠碳、二氧化鉑等價(jià)格昂貴。與之相比，生物法具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性強(qiáng)、副反應(yīng)少和產(chǎn)物得率高等優(yōu)點(diǎn)。化學(xué)法與生物酶法具有互補(bǔ)的優(yōu)勢，化學(xué)法與生物酶法相結(jié)合合成手性含氮飽和雜環(huán)醇應(yīng)是行之有效的策略，利用化學(xué)法從廉價(jià)易得的原料合成前體含氮飽和雜環(huán)酮，然后通過生物酶法不對稱合成高光學(xué)純度的手性含氮飽和雜環(huán)醇。生物法合成手性含氮飽和雜環(huán)醇包括脂肪酶催化的選擇性拆分、單加氧酶催化的選擇性羥基化和羰基還原酶催化的不對稱還原等，其中又以羰基還原酶催化的不對稱還原法最有成效。羰基還原酶催化的酶反應(yīng)需要高效的生物催化劑和高效的輔酶循環(huán)系統(tǒng)。除了個(gè)別極為成功的案例外，目前研究報(bào)道的生物催化劑在催化活性、底物及有機(jī)試劑耐受性、穩(wěn)定性、可重復(fù)利用性等方面離工業(yè)催化的要求尚有較大距離。因此，后續(xù)研究不僅僅需要發(fā)現(xiàn)更高效的生物催化劑，還需要利用基因工程和蛋白質(zhì)工程等技術(shù)快速而有效地改造酶的催化特性，從而滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

[1]DEYINE A,POIRIER J,DUHAMEL L,et al.Synthesis of racemic nitramine,isonitramineand sibirine[J].Tetrahedron Letters,2005,46(14):2491-2493.

[2]CHOI I,LEE HG,CHUNG K.Efficient stereoselective synthesis of α-hydroxy aldehydes with(R)-piperidin-3-ol as a new chiral auxiliary[J].Journal of Organic Chemistry 2001,66:2484-2486.

[3]AMAT M,LLOR N,HUGUET M,et al.Unprecedented oxidation of a phenylglycinol-derived 2-pyridone:enantioselective synthesis of polyhydroxypiperidines[J].Organic Letters,2001,3(21):3257-3260.

[4]REDDY M S,NARENDER M,RAO K R.A new asymmetric synthetic route to substitutedpiperidines[J].Tetrahedron,2007,63(2):331-336.

[5]LACHERETZ R,PARDO D G,COSSY J,et al.Daucus carota mediated-reduction of cyclic 3-oxo-amines[J].Organic Letters,2009,11(6):1245-1248.

[6]JU Xin,TANG Yuanyuan,LIANG Xiaoliang,et al.Development of a biocatalytic process to prepare(S)-N-Boc-3-hydroxypiperidine[J].Organic Process Research&Development,2014,18(6):827-830.

[7]ZHANG Wenxia,XU Guochao,HUANG Lei,et al.Highly efficient synthesis of(R)-3-quinuclidinol in a space-time yield of 916 g L-1d-1using a new bacterial reductase ArQR[J].Organic Letters,2013,15(19):4917-4919.

[8]李書彬，申永存，曾鵬，等．3-奎寧醇的拆分研究[J]．安徽化工，2009，35(1)：31-33．

[9]TSUTSUMI K,KATAYAMA T,UTSUMI N,et al.Practical asym metric hydrogenation of 3-quinuclidinone catalyzed by the XylSkewphos/PICA-Ruthenium(II)complex[J].Organic Process Research&Development,2009,13(3):625-628.

[10]UZURA A,NOMOTO F,SAKODA A,et al.Stereoselective synthesis of(R)-3-quinuclidinol through asymmetric reduction of 3-quinuclidinone with 3-quinuclidinone reductase of Rhodotorula rubra[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,83(4):617-26.

[11]ISOTANI K,KUROKAWA J,ITOH N.Production of(R)-3-quinuclidinol by E.coli biocatalysts possessing NADH-depen dent 3-quinuclidinone reductase(QNR or bacC)from Microbacterium luteolum and Leifsonia alcohol dehydrogenase(LSADH)[J].Molecular Sciences,2012,13(10):13542-13553.

[12]WANG Yu,LI Jianjiong,WU Qiaqing,et al.Microbial stereospecific reduction of 3-quinuclidinone with newly isolated Nocardia sp.and Rhodococcus erythropolis[J].Molecular Catalysis B:Enzymatic,2013,88:14-19.

[13]KOLET S P,JADHAVA D D,PRIYADARSHINI B,et al.Fungi mediated production and practical purification of(R)-(-)-3-quinuclidinol[J].Tetrahedron Letters,2014,55(43):5911-5914.

[14]韓小兵，陳國榮，李援朝．3-吡咯烷酮鹽酸鹽的合成[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2002，33(9)：423-424．

[15]劉前，吳松．(S)-N-芐基-3-羥基吡咯烷的合成[J]．化學(xué)試劑，2010，32(9)：843-844．

[16]ZHANG Wei,TANG Wenglin,WANG Zunsheng,et al.Regioand stereoselective biohydroxylations with a recombinant Escherichia coli expressing P450pyr monooxygenase of Sphingomonas sp.HXN-200[J].Advanced Synthesis&Catalysis,2010,352(18):3380-3390.

[17]ITOH N,MATSUDA M,MABUCHI M,et al.Chiral alcohol production by NADH-dependent phenylacetaldehyde reductase coupled within situregeneration of NADH[J].European Journal of Biochemistry,2002,269(9):2394-402.

[18]MAKINO Y,INOUE K,DAIRI T,et al.Engineering of phenylacetaldehyde reductase for efficient substrate conversion in concentrated 2-propanol[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(8):4713-4720.

[19]YAMADA-ONODERA K,KOJIMA K,TAKASE Y,et al.Cloning,sequence analysis,and expression in Escherichia coli of gene encoding N-benzyl-3-pyrrolidinol dehydrogenase from Geotrichum capitatum[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2007,104(5):379-384.