曲普瑞林抑制子宮平滑肌瘤細胞的性激素受體表達、誘導(dǎo)瘤細胞凋亡

楊靜，楊娟，徐亞吉

（1四川省林業(yè)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610000；2重慶新橋醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400037；3 成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，成都 610000）

子宮平滑肌瘤簡稱子宮肌瘤，是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤之一，約有30%～50%的女性患有子宮肌瘤[1]。子宮肌瘤引起一系列婦科癥狀，包括盆腔疼痛及出血等[2]。目前尚無有效的藥物來治療子宮肌瘤，許多患者最終需行子宮切除術(shù)[3]。美國每年約有60萬例患者進行子宮切除術(shù)，其中約一半患者與子宮肌瘤有關(guān)[4]。

研究表明[5]，子宮肌瘤的發(fā)展與性激素水平及其受體有關(guān)。在子宮肌瘤中，雌激素和孕激素之間通過自分泌和旁分泌作用互相調(diào)節(jié)，雌激素可增加肌瘤細胞中孕激素受體含量，孕激素又可進一步促進雌激素含量，并且雌激素和孕激素能共同促進子宮肌層平滑肌細胞轉(zhuǎn)變成肌瘤細胞和進一步共同促進平滑肌瘤的生長[6]。有研究表明[7]，促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone agonists,GnRH）的激動劑（gonadotropin releasing hormone agonists, GnRHA）能有效改善子宮肌瘤的癥狀，其機制主要是由于GnRHA刺激后，雌激素和孕激素水平一過性升高，隨即下降，使垂體中GnRH受體表達下調(diào)。GnRH受體也在垂體外的組織例如子宮內(nèi)膜以及子宮肌層中表達[8]。GnRH以垂體自分泌或旁分泌的方式作用于垂體外組織，調(diào)節(jié)細胞增殖及凋亡[9]。此外，GnRHA也可直接作用于子宮肌瘤組織，誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。GnRHA可上調(diào)促凋亡蛋白Bax及FasL，降低抗凋亡因子Bcl-2的水平來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[10]。此外，GnRHA也可通過抑制Akt及ERK1/2的活性來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[11]。

GnRHA藥物亮丙瑞林可減少子宮肌瘤患者的子宮體積、腫瘤體積及出血，同時降低雌激素及孕酮水平[12]。但亮丙瑞林長期服用后可伴有較嚴重的副作用，它可產(chǎn)生短暫的絕經(jīng)反應(yīng)且大多數(shù)肌瘤會抵抗亮丙瑞林的效應(yīng)，盡管如此，仍有64%的患者對亮丙瑞林有較強的敏感性。曲普瑞林（triptorelin,TPRL）與亮丙瑞林類似，也是一種GnRHA類藥物，但其安全性及對子宮肌瘤的敏感性要優(yōu)于亮丙瑞林等其他GnRHA類藥物[13]。為了為揭示曲普瑞林抑制子宮肌瘤生長的機制，本研究首先檢測了心肌素對人源平滑肌瘤細胞的SM22α及α-SMA表達的影響及曲普瑞林對該影響的作用，并分析了曲普瑞林對小鼠皮下成瘤組織中ERα、PR-A及PR-B表達、Caspase-3和Ki67水平的影響。

材料與方法

1 實驗動物

雌性胸腺缺失裸鼠（5～6周齡），購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所[SCXK(川)2018-0015]，飼養(yǎng)于成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所SPF級實驗動物房[SYXK(川)2014-021]，飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度45%～55%，每天光照12h，飼養(yǎng)1周后進行實驗。

2 主要實驗試劑

曲普瑞林購買自益普生法國生物技術(shù)公司；心肌素（myocardin，MCD）的過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-MCD）以及對照空載體質(zhì)粒（pcDNA3.1-vector）由武漢金開瑞生物工程公司合成；胎牛血清（FBS）以及DMEM培養(yǎng)基購買自美國Hyclone公司。青霉素、鏈霉素和Lipofectamine 3000購買自美國Invitrogen公司。BCA試劑盒購自美國Thermo公司；PVDF膜和ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；Alexa Fluor或HRP標記的二抗購買自武漢艾美捷生物科技有限公司；抗孕激素受體A (progesterone receptor A, PR-A)抗體（sc-9685）購買自美國Santa Cruz公司；抗SM22α（ab18735）和雌激素受體α（estrogen receptor α, ERα）抗體（ab23706）購買自美國Abcam公司；抗孕激素受體B （progesterone receptor B，PR-B）（9865）和Caspase-3抗體（4006）購買自美國Cell Signaling Technology公司；抗Ki67抗體（AC-5595）購買自美國Proteintech公司；抗α-SMA抗體（BD5197）購買自美國Bioss公司。

3 細胞培養(yǎng)

選取術(shù)中取下的患者子宮肌瘤組織，胰酶消化后的子宮平滑肌瘤細胞生長于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。當細胞處于對數(shù)生長期時，使用含有EDTA的0.25% 胰蛋白酶將細胞消化使用培養(yǎng)基重懸后接種于不同器皿中進行后續(xù)實驗。

4 細胞轉(zhuǎn)染與分組處理

對數(shù)生長期的人源子宮平滑肌瘤細胞按照1.0×105細胞/孔的密度接種于6孔板，待細胞貼壁后，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞12 h利用Lipofectamine 3000分別輔助轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCD和pcDNA3.1-vector。然后更換含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞24h。收集已轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCD和pcDNA3.1-vector的子宮平滑肌瘤細胞，按照實驗?zāi)康姆譃閷φ战M（Con）、心肌素處理組（MCD）和心肌素聯(lián)合曲普瑞林處理組（MCD+TPRL）。其中對照組采用已轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-vector的子宮平滑肌瘤細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h；心肌素處理組采用已轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCD的子宮平滑肌瘤細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h；心肌素聯(lián)合曲普瑞林處理組采用20nmol/L曲普瑞林預(yù)處理已轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MCD的子宮平滑肌瘤細胞 30min后，再培養(yǎng)細胞24h。

5 免疫熒光檢測

取對數(shù)生長期的人源子宮平滑肌瘤細胞接種于共聚焦顯微鏡專用8連孔培養(yǎng)板中，按照上述分組的處理方法進行處理細胞。待細胞處理達到時間終點后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌5min，然后使用4%多聚甲醛在室溫下進行固定15min，之后使用PBST洗滌5min 3次。再使用0.1% Triton X-100進行穿孔，并再次洗滌。加入1:2000稀釋比例的SM22α抗體，4 ℃孵育過夜。次日孵育結(jié)束后，加入1:1000稀釋比例的Alexa Fluor標記的二抗在37℃避光孵育1h，然后利用5mg/ml的DAPI試劑在室溫避光條件下染細胞核5min。最后，每組細胞在激光共聚焦顯微鏡隨機獲得5個視野的細胞熒光染色圖像。

6 裸鼠皮下成瘤

皮下成瘤方法：培養(yǎng)ELT-3細胞，以（1.0×107細胞/只）注射入裸鼠背部皮下。2～3周后待瘤組織可見時進行實驗。10只裸鼠皮下成瘤后分為兩組，分別為對照組（Con）和曲普瑞林干預(yù)組（TPRL），每組5只裸鼠。TPRL組腹腔注射曲普瑞林（300 mg/kg/d），每周3次，連續(xù)注射4周；對照組注射等量生理鹽水。

7 免疫組織化學(xué)檢測

分離裸鼠皮下瘤組織后，經(jīng)4%多聚甲醛固定、30%蔗糖脫水、石蠟包埋后制作5μm厚度切片。石蠟切片經(jīng)枸椽酸鈉高溫修復(fù)，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，以1:200稀釋比例孵育第一抗體（ERα、PR-A、PR-B、Caspase-3和Ki67），4℃過夜；次日，PBS洗滌后用1:500稀釋比例HRP標記的二抗孵育1h，之后用DAB顯色液染色5min，蘇木精復(fù)染30s，最后，每組切片的每個染色在倒置顯微鏡下隨機獲得5個視野的免疫組化染色圖像。

8 Western blot法檢測蛋白水平

取經(jīng)處理的細胞或裸鼠皮下成瘤組織利用RIPA裂解液萃取細胞全蛋白，BCA法測定蛋白濃度并將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取15μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜， 100V恒壓轉(zhuǎn)膜2h。之后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1h，并以1:2000的稀釋比例孵育第一抗體（SM22α和α-SMA），4℃過夜。次日，以TBST洗滌后室溫孵育1:10000稀釋比例的HRP標記的二抗1h，以TBST洗滌后利用ECL法發(fā)光，成像儀顯影。

9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，并利用SPSS 17.0軟件進行后續(xù)統(tǒng)計學(xué)分析。對于兩組定量資料和多組定量資料的比較，數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布和方差齊的條件下，分別采用雙側(cè)t檢驗和單因素方差分析方法。當P＜0.05時，差異被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 曲普瑞林降低人源平滑肌瘤細胞中由心肌素誘導(dǎo)的SM22α和α-SMA上調(diào)

SM22α與α-SMA是平滑肌細胞骨架蛋白，其過表達可誘導(dǎo)細胞向平滑肌分化[14]，心肌素可誘導(dǎo)平滑肌細胞的增殖或分化[15]。為了闡明曲普瑞林對人源平滑肌瘤細胞分化的抑制作用，本研究利用心肌素過表達誘導(dǎo)人源平滑肌瘤細胞分化，同時給予曲普瑞林干預(yù)，檢測曲譜瑞林對平滑肌瘤細胞分化的影響。免疫熒光檢測顯示，經(jīng)心肌素誘導(dǎo)后，人源平滑肌瘤細胞SM22α免疫反應(yīng)性明顯上調(diào)，而給予曲普瑞林后，與心肌素誘導(dǎo)細胞相比，SM22α免疫反應(yīng)性明顯降低（圖1）。Western blot分析顯示，經(jīng)心肌素誘導(dǎo)后，平滑肌瘤細胞SM22α與α-SMA水平顯著上調(diào)，而給予曲普瑞林后，與心肌素誘導(dǎo)細胞比較組，SM22α與α-SMA水平明顯降低。由此提示曲普瑞林可抑制平滑肌瘤細胞的分化。

2 曲普瑞林降低體外成瘤組織ER-α、PR-A及PRB水平

為了闡明曲普瑞林在體內(nèi)的抑瘤效果，本研究利用ELT-3細胞皮下移植成瘤實驗，并給予曲普瑞林干預(yù)，結(jié)果顯示，曲普瑞林干預(yù)后，腫瘤組織的體積較對照組相比明顯縮小（圖3）。對三種性激素受體，ER-α、PR-A及PR-B的免疫組織化學(xué)檢測顯示，經(jīng)曲普瑞林干預(yù)后，這三種受體的水平明顯降低（圖3）。由此提示曲普瑞林可能通過抑制雌激素受體及孕激素受體來抑制腫瘤生長。

3 曲普瑞林誘導(dǎo)體外成瘤組織細胞凋亡和抑制增殖

為了研究曲普瑞林的抑瘤機制，對體外成瘤組織內(nèi)Caspase-3及Ki67水平進行了免疫組織化學(xué)染色檢測，結(jié)果顯示，曲普瑞林可增高腫瘤組織Caspase-3陽性細胞數(shù)并降低Ki67免疫細胞化學(xué)陽性細胞數(shù)（圖4）。

圖1 曲普瑞林降低子宮平滑肌瘤細胞內(nèi)由心肌素誘導(dǎo)的SM22α免疫反應(yīng)性上調(diào)（免疫熒光染色，DAPI復(fù)染細胞核）。比例尺，20μmFig. 1 Triptorelin inhibited myocardin-induced increase of SM22α immunoreactivity in the leiomyoma cells (immuno flurescent staining with DAPI counterstain of nuclei). Scale bar, 20μm

圖2 曲普瑞林降低平滑肌瘤細胞中由心肌素導(dǎo)致的α-SMA和SM22α水平上調(diào)。A, 代表性Western blot檢測SM22α和α-SMA水平；B，SM22α水平的統(tǒng)計學(xué)分析；C，α-SMA水平的統(tǒng)計學(xué)分析；**0.001＜P＜0.01 vs 心肌素處理組；###P＜0.001 vs 對照組；n=3Fig. 2 Triptorelin inhibited myocardin-induced up-regulation of α-SMA and SM22α levels in the leiomyoma cells. A, representative Western blot detection for levels of SM22α and α-SMA; B, statistical analysis for SM22α level; C, statistical analysis for α-SMA level; ** 0.001＜P＜0.01 vs myocardin group. ### P＜0.001 vs control group; n= 3

討 論

本研究首先利用人源子宮平滑肌瘤細胞，發(fā)現(xiàn)曲普瑞林可抑制由心肌素誘導(dǎo)的SM22α及α-SMA表達水平的上調(diào)。SM22α與α-SMA是平滑肌細胞骨架蛋白，其在平滑肌的分化過程中具有重要的意義[14]。有研究表明[16]，子宮平滑肌瘤中平滑肌細胞的SM22α與α-SMA表達上調(diào)可促進子宮肌瘤的發(fā)展，而抑制SM22α與α-SMA可緩解子宮平滑肌瘤的生長分化，與本研究結(jié)果一致。因此，曲普瑞林可抑制人源子宮平滑肌瘤細胞的分化及發(fā)展。

圖3 曲普瑞林對腫瘤生長及腫瘤組織內(nèi)ER-α、PR-A和PR-B水平的影響。與對照組比較：**0.01＜P＜0.01；*** P＜0.001；n=5；比例尺，100μmFig. 3 Effects of triptorelin on growth of tumors and levels of ER-α, PR-A, and PR-B in tumors. Compared with control group: **0.001＜P＜0.01; ***P＜0.001; n=5; scale bar, 100μm

子宮平滑肌瘤常見于30～50歲女性，而在20歲以下女性中較罕見，其發(fā)生常見育齡期，其發(fā)生可能與性激素有關(guān)[17]。高表達的性激素受體PR-A、PR-B及ERα可以促進子宮平滑肌瘤細胞增殖[18]。為了驗證曲普瑞林對體內(nèi)成瘤的抑制效應(yīng)，本研究利用大鼠腫瘤來源的ELT-3細胞移植入裸鼠皮下，并給予曲普瑞林干預(yù)，結(jié)果表明，曲普瑞林可降低瘤組織PR-A、PR-B及ERα的表達水平，誘導(dǎo)細胞凋亡標志性蛋白Caspase-3表達上調(diào)及抑制腫瘤增殖標志性蛋白Ki67表達，從而抑制腫瘤組織生長，但具體機制尚不清楚。有研究表明[19]，曲普瑞林可通過抑制MAPK和NF-κB通路活性，從而抑制細胞增殖。另外，曲普瑞林也可通過抑制ERK和鈣通道信號通路抑制前列腺癌細胞增殖[20]。

圖4 曲普瑞林對體外成瘤組織內(nèi)Caspase-3和Ki67水平影響的免疫組織化學(xué)檢測。與對照組比較：**0.01＜P＜0.01；*** P＜0.001；n=5；比例尺，100μmFig. 4 Immunohistochemical examination for effect of triptorelin on levels of Caspase-3 and Ki67 in in subcutaneous tumorigenic tissues. Compared with control group: **0.001＜P＜0.01; *** P＜0.001; n=5; scale bar, 100μm

本研究未進行子宮肌層結(jié)構(gòu)的分析來闡明曲普瑞林對瘤組織與正常子宮肌層的作用差異，也未檢測曲普瑞林對正常子宮平滑肌細胞的毒性。子宮壁內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，包括生長因子、炎癥因子和免疫細胞對GnRHA敏感程度與本研究使用的皮下腫瘤模型可能存在差異，因此，建立有效的腫瘤原位種植方法來闡明曲普瑞林的藥效學(xué)作用將更有說服力。