靈芝多糖的結(jié)構(gòu)及其表征方法研究進展

張 匯 聶少平 艾連中 夏永軍 熊智強 王光強*

（1 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心 上海 200093

2 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌 330047）

靈芝屬真菌門、擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝科、靈芝屬，主要生長于朽木或樹樁上，在我國及亞洲幾個國家（如日本、韓國）廣泛使用，被認為具有調(diào)節(jié)人體機能平衡和延年益壽的功效[1]。靈芝種類繁多，目前全球已發(fā)現(xiàn)并報道的靈芝品種超過80個，然而，由于靈芝同義詞的濫用，所以很難對靈芝進行精確的種屬劃分[2]。日本的“Reishi”，韓國的“Youngzhi”以及中國的“靈芝”，在英文中都被翻譯成“Ganoderma”，它們是否屬于同一實體，還有待商榷。在我國古典藥書《神農(nóng)本草經(jīng)》中，靈芝按顏色劃分為青、赤、黃、白、黑和紫6種；此外，我國還分布有松杉靈芝、樹舌、薄蓋靈芝、云芝等。

靈芝子實體中的化學(xué)成分豐富，被認為是活性物質(zhì)的生物制造工廠[3]。多糖和三萜類物質(zhì)是其中最主要的功能成分，此外，還含有核酸類、呋喃類、甾醇類、生物堿類和氨基酸多肽類等[4]。自1981年 Miyazaki等[5]從靈芝子實體（G.lucidum）中分離出高支化的阿拉伯木糖基葡聚糖，并證實具有抗腫瘤活性以來，關(guān)于靈芝多糖的報道越來越多。大部分報道的靈芝多糖為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖和阿拉伯糖通過不同比例和不同糖苷鍵類型連接構(gòu)成，部分靈芝多糖上還復(fù)合了蛋白或多肽殘基以及酚類物質(zhì)等。而對于靈芝多糖的功能研究則主要集中于生物活性功能，現(xiàn)有研究表明：靈芝多糖在免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，抗氧化，降血糖，調(diào)節(jié)腸道健康等方面具有良好的生理功能[3，6]，由此也引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。眾所周知，靈芝多糖的生物活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特征有著緊密的聯(lián)系。要研究靈芝多糖生物活性的機理及其構(gòu)效關(guān)系，就需要對其結(jié)構(gòu)特征進行詳細、準確的表征。為此，本文總結(jié)近年來靈芝多糖的結(jié)構(gòu)特征研究情況，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代儀器分析技術(shù)，綜述多糖結(jié)構(gòu)表征的方法學(xué)研究進展，為靈芝多糖一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的深入研究提供參考。

1 靈芝多糖的提取與分級

根據(jù)多糖在靈芝中的存在部位及其溶解性，可分別采用熱水浸提[7]、鹽溶液浸提[8]和堿液提取[9]等方式獲得靈芝多糖。熱水和鹽溶液提取法遵循中藥的煎煮原則，具有簡便安全和環(huán)保等特點，是最常見的多糖提取方法；而堿液提取主要是從細胞壁中萃取出不溶于水的高分子質(zhì)量的多聚糖。不同溶劑提取得到的靈芝多糖結(jié)構(gòu)存在較大差異，通常，熱水提取的多糖為水溶性雜多糖，而堿液提取的多糖為水不溶性的葡聚糖。

多糖的分離與分級方法包括Sevage法脫蛋白、乙醇分級沉淀法、季銨鹽沉淀法、凍融法、陰離子交換柱層析、凝膠滲透色譜、膜分離法等[10]。分級方法的選擇取決于多糖的性質(zhì)、組成及分離的目的等，總體遵循先除雜，后細分的原則。靈芝子實體的水提物是一種非常復(fù)雜的混合物，其中含有一定量的色素類物質(zhì)，因此需要對其進行脫色處理。常用的脫色方法包括雙氧水氧化法和活性炭吸附法，然而，這兩種方法都會影響多糖的結(jié)構(gòu)或得率[11]。目前，陰離子交換色譜被廣泛用于多糖的脫色和分級[12]。表1總結(jié)了不同分級方法的原理及其在靈芝多糖中的應(yīng)用。

表1 多糖分級的方法及其在靈芝多糖中的應(yīng)用Table1 Methods for fractionation of polysaccharides and the application on Ganoderma polysaccharides

在靈芝多糖的分級過程中，通常需要結(jié)合2～3種分級方法，才能達到對樣品的純度要求，其中，陰離子交換色譜結(jié)合凝膠滲透色譜是最常見的分級手段[16-18]，其主要原理是首先通過陰離子交換色譜將靈芝多糖中的中性多糖和酸性多糖進行分離，再通過凝膠滲透色譜對不同分子質(zhì)量的多糖級分進行分級。Zhang等[21]也報道直接采用陰離子交換色譜可將靈芝多糖中不同性質(zhì)的多糖成分和雜質(zhì)進行分離，得到高純度的多糖組分。

2 靈芝多糖的一級結(jié)構(gòu)

2.1 靈芝多糖的單糖組成

多糖的一級結(jié)構(gòu)包括單糖組成、糖連接方式和連接序列等。不同來源的靈芝多糖其單糖組成雖存在差異性，但主要以葡萄糖和半乳糖為主，有些還含有甘露糖、巖藻糖、木糖和阿拉伯糖等。Ye等[22]從赤靈芝子實體中分離得到了一種巖藻糖基半乳聚糖，通過高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測技術(shù)（HPAEC-PAD）證實其由巖藻糖、葡萄糖和半乳糖以1∶1∶5的比例組成；Wang等[16]從松杉靈芝中分離得到了14種水溶性和15種水不溶性的多糖組分，發(fā)現(xiàn)水溶性的多糖為結(jié)合有蛋白的葡萄糖基半乳聚糖，單糖組成包括葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和甘露糖，而水不溶性的多糖為結(jié)合有蛋白的β-（1→3）-葡聚糖；從黑靈芝不同部位（菌柄、菌蓋和孢子粉）中提取得到的多糖，其單糖均主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成，而比例有顯著差別，其中，黑靈芝孢子粉多糖主要由葡萄糖組成，含有極少量的半乳糖和甘露糖，而菌柄和菌蓋多糖中半乳糖和甘露糖的含量則有所提高[23]。

2.2 靈芝多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)

根據(jù)現(xiàn)有研究報道，靈芝多糖按化學(xué)組成可分為均多糖和雜多糖兩大類，其中均多糖主要為葡聚糖類；而雜多糖的結(jié)構(gòu)則較為復(fù)雜。

β-（1→3）-葡聚糖被認為是具有良好生物活性的多糖化合物，可是由于其可形成剛性的螺旋結(jié)構(gòu)，在水中的溶解性很差，需要用堿性溶液進行溶解。Ukai等[24]首次從紫靈芝子實體中分離得到了一種堿溶性的β-（1→3）-葡聚糖；隨后，Sone等[25]從赤靈芝子實體和菌絲體培養(yǎng)液中提取得到了水不溶性的β-（1→3）-葡聚糖。水不溶性的β-（1→3）-葡聚糖為支化度較低的線型分子，呈剛性鏈狀；而對含有支鏈的的葡聚糖，其水溶性可大大改善。Liu等[13]采用熱水浸提從赤靈芝子實體中分離出一種高分子質(zhì)量的β-葡聚糖，證實其分子結(jié)構(gòu)單元是以β-（1→3）-葡聚糖為主鏈，每隔兩個葡萄糖中有一個O-6位的支鏈（圖1）。Bao等[18]從赤靈芝子實體中分離得到一種水溶性的高支化葡聚糖，其中主鏈由β-（1→3）-葡萄糖構(gòu)成，而支鏈點出現(xiàn)在O-6位置，支鏈結(jié)構(gòu)為（1→6）-葡萄糖。Amaral等[26]則從無柄靈芝（G.resinaceum）中分離得到了一種高支化的水溶性β-（1→3）-葡聚糖，在O-6位置出現(xiàn)支鏈點，支鏈結(jié)構(gòu)為（1→4）-葡萄糖。此外，靈芝孢子粉中也含有大量的β-（1→3）-葡聚糖，Bao等[27]報道了赤靈芝孢子粉中的主要多糖為以β-（1→3）-葡萄糖為主鏈，支鏈為不同聚合度的β-（1→3）和（1→6）-葡萄糖鏈，剛果紅試驗證明該多糖可形成與香菇多糖類似的三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。

圖1 赤靈芝子實體中β-葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)單元[13] Fig.1 Repeating unit ofβ-Glucan from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum[13]

靈芝中還含有一類葡聚糖：α-（1→3）-葡聚糖，它主要存在于細胞壁內(nèi)，因此很難直接用熱水提取出來，而需要用鹽溶液或堿液進行萃取，分離得到的α-（1→3）-葡聚糖通常為水不溶性的多糖。Bao等[28]采用堿液從赤靈芝的破壁孢子粉中分離得到一種水不溶性多糖，通過核磁共振（NMR）和紅外光譜（FT-IR）證實其為線型的α-（1→3）-葡聚糖，通過化學(xué)改性制備了該多糖的不同修飾產(chǎn)物，結(jié)果表明水不溶性的α-（1→3）-葡聚糖沒有生物活性，而修飾產(chǎn)物的水溶解性大大改善，并具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性；Zhang等[9]通過堿液提取從黑靈芝子實體中分離得到一種高分子鏈的線型α-（1→3）-葡聚糖，該多糖不溶于水，而通過硫酸化修飾可有效改善其水溶解性，且修飾產(chǎn)物具有良好的抑制腫瘤細胞生長的作用。

靈芝中的雜多糖種類很多，主鏈主要以葡萄糖、半乳糖和甘露糖為主，支鏈中含巖藻糖、木糖和阿拉伯糖等糖單元。Miyazaki等[5]首次報道的赤靈芝多糖是一種水溶性的高支化阿拉伯木糖基葡聚糖，主鏈主要由 α和β-（1→4）-葡萄糖、β-（1→6）-和β-（1→3）-葡萄糖構(gòu)成。而 Usui等[20]則首次從樹舌靈芝中分離得到兩種雜半乳聚糖，其主鏈均由 α-（1→6）-半乳糖構(gòu)成，且均被 O-乙?；糠秩〈ф溨袆t由巖藻糖和甘露糖組成。Bao等[18]從赤靈芝子實體中分離得到兩種雜多糖（PL-1和PL-4），其主鏈分別由 α-D-（1→4）-葡萄糖、β-D-（1→6）-半乳糖和β-（1→3），β-（1→4），β-（1→6）-葡萄糖、β-（1→6）-甘露糖組成。Ye等[29]則從赤靈芝子實體中分離得到了一種糖肽，其聚糖部分的主鏈由 α-（1→6）-半乳糖和α-（1→3）-葡萄糖構(gòu)成，支鏈點出現(xiàn)在半乳糖的O-2位置，支鏈則由巖藻糖組成。Zhang等[30-31]從黑靈芝中分離得到了兩種低分子量的水溶性雜多糖PSG-1-F0.2和PSG-2，其中，PSG-1-F0.2是一種高支化的酸性 β-（1→3，1→6）-葡聚糖，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元如圖2a所示；而PSG-2則為一種含有乙?；碾s半乳聚糖，其主鏈為α-（1→6）-半乳聚糖，支鏈中含有巖藻糖、甘露糖和葡萄糖，其重復(fù)單元結(jié)構(gòu)如圖2b所示。

圖2 黑靈芝子實體中兩種水溶性多糖的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)[30-31] Fig.2 Repeat unit of two water-soluble polysaccharides from the fruiting bodies of Ganodernra atrum[30-31]

綜上可知，靈芝多糖種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有報道的靈芝多糖結(jié)構(gòu)已達200多種，其中既含有雜多糖，也包含葡聚糖；其單糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和巖藻糖等組成，而單糖間的糖苷鍵包括（1→3）、（1→4）、（1→6）等連接方式；大多數(shù)靈芝多糖有分支，部分還含有蛋白或多肽片段，形成糖蛋白或蛋白聚糖結(jié)構(gòu)[32]。

3 靈芝多糖的分子質(zhì)量及其構(gòu)象特征

不同種類或不同來源的靈芝，其多糖成分的分子質(zhì)量（Mw）有較大差異，主要在104u數(shù)量級，也有報道靈芝多糖的Mw在106u范圍。靈芝β-葡聚糖是靈芝中的主要活性成分，其分子質(zhì)量分布在104～105范圍，Bao等[18]報道的赤靈芝子實體中β-（1→3）-葡聚糖的Mw為6.3×104u；無柄靈芝中的高支化 β-（1→3）-葡聚糖的Mw為2.6×104u[26]；而 Liu 等[13]報道的赤靈芝子實體中 β-（1→3）-葡聚糖則為高分子質(zhì)量的級分，其在水溶液中的Mw為3.75×106u。靈芝 α-（1→3）-葡聚糖的Mw 則相對較大，分布在105～106u范圍內(nèi)，如赤靈芝孢子粉中的α-（1→3）-葡聚糖的Mw為1.26×105u[28]，而黑靈芝中 α-（1→3）-葡聚糖的Mw則為1.665×106u[9]。靈芝中的雜多糖多為水溶性較好的多聚糖，其分子質(zhì)量相對較小，主要分布在103～104u范圍內(nèi)，如赤靈芝中的阿拉伯木糖基葡聚糖的Mw為4×104u[32]，松杉靈芝中的β-半乳糖基-α-甘露聚糖的Mw為8.35×104u[33]，而從黑靈芝中分離得到的一種雜半乳聚糖Mw為6.9×104u[31]；此外，Huang等[34]報道了一種高分子質(zhì)量的赤靈芝中性多糖，其 Mw 達 2.5×106u。

構(gòu)象屬于多糖的高級結(jié)構(gòu)，研究表明，多糖的功能性質(zhì)不僅與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)，還與其在溶液中的空間構(gòu)象有著密切聯(lián)系[35]。多糖在溶液中的構(gòu)象特征表征方式有多種，如多糖分子的尺寸、大小、形態(tài)、黏度、柔順性/剛性等，多糖在溶液中的形態(tài)主要包括：球形鏈、無規(guī)線團、半柔性鏈、剛性棒狀、單股螺旋、雙股螺旋和三股螺旋等[36]。

靈芝中的β-（1→3）-葡聚糖由于其結(jié)構(gòu)較為規(guī)整，容易形成螺旋結(jié)構(gòu)，因此，其在溶液中通常呈現(xiàn)為剛性鏈狀。Bao等[27]通過剛果紅實驗證實從赤靈芝孢子粉中提取得到的葡聚糖SP在水溶液中的構(gòu)象與Curdlan的三股螺旋構(gòu)象相似，從而證明SP在水溶液中呈現(xiàn)一定的有序構(gòu)象。從赤靈芝子實體中分離得到的一種高分子質(zhì)量的β-（1→3）-葡聚糖，光散射技術(shù)研究表明該多糖在0.9%的NaCl溶液中呈剛性鏈狀，而在DMSO中則呈無規(guī)線團[13]。

對于支化度較小的靈芝雜多糖，由于結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜、糖苷鍵連接方式多樣，其在溶液中通常呈現(xiàn)為無規(guī)線團或棒狀結(jié)構(gòu)；而對于高支化的靈芝多糖，則呈現(xiàn)緊湊卷曲的結(jié)構(gòu)。Peng等[37]對松杉靈芝菌絲體中提取得到的一種堿溶性多糖GM5-1的鏈構(gòu)象進行研究，測定了GM5-1在0.25 mol/L LiCl/DMSO溶液中的Mw及特性黏度[η]，并建立了[η]與Mw以及回旋半徑Rg與Mw之間的關(guān)系，結(jié)果表明GM5-1在0.25mol/L LiCl/DMSO溶液中是以半柔性鏈的構(gòu)象存在。同時，Peng等[38]對松杉靈芝菌絲體中提取得到的另一種堿溶性多糖GM6-1的溶液性質(zhì)也進行了研究，結(jié)果表明GM6-1在0.25mol/L LiCl/DMSO溶液中是以無規(guī)卷曲的形式存在。Wang等[8]從赤靈芝中分離出5種水溶性的雜多糖（GL-1-GL-V），結(jié)果表明，高支化的雜多糖GL-1在0.9%NaCl溶液中為緊湊的線團形式，而隨著支化度減小，糖鏈逐漸變成柔性鏈。Lai等[39]從赤靈芝中分離得到多糖GLFP和GLMP，當(dāng)用水作為溶劑時，Huggins常數(shù)為0.59～0.93，表明在一定程度上發(fā)生了多糖分子的聚集，然而如果用DMSO作為溶劑時Huggins常數(shù)則變小，表明多糖分子在DMSO中相互作用減弱，黏度下降。

盡管靈芝多糖的構(gòu)象特征研究有了一些成果，但關(guān)于其分子形態(tài)和分子尺寸的數(shù)據(jù)還較為欠缺，有待于進一步分析和闡明。

4 多糖結(jié)構(gòu)與構(gòu)象方法學(xué)研究進展

4.1 靈芝多糖一級結(jié)構(gòu)分析方案

靈芝多糖中存在多種單糖種類，而連接方式又多樣，因此，靈芝多糖的結(jié)構(gòu)分析與小分子或其它生物大分子不同，需要有特殊的方法和技術(shù)。通常，多糖一級結(jié)構(gòu)的確定需要得到如下信息：單糖組成、糖苷鍵的連接方式、糖環(huán)的類型、異頭構(gòu)型以及糖殘基的連接順序等，多糖上游離的羥基還會發(fā)生取代，如甲基取代、乙?；〈?、硫酸基取代等，這時，也需要提供這些特征基團的信息[40]。因此，多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的解析需要結(jié)合不同的化學(xué)和儀器分析方法進行綜合鑒定。綜合多糖一級結(jié)構(gòu)的解決方案，圖3概括了靈芝多糖結(jié)構(gòu)表征的常用方法及其對應(yīng)所能得到的信息。

圖3 靈芝多糖一級結(jié)構(gòu)分析方案Fig.3 Procedure for the primary structure analysis of Ganoderma polysaccharide

4.2 單糖組成分析

單糖是多糖的最小組成單元，靈芝多糖中常見的單糖包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等。要獲得單糖組成信息，就需要對多糖樣品進行完全酸水解處理，通過強酸溶液（三氟乙酸、硫酸等）在高溫下破壞糖苷鍵，使單糖逐漸游離水解出來，再通過化學(xué)方法和儀器分析對單糖進行定性和定量分析。如圖3所示，單糖組成分析的方法包括氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）和HPAEC-PAD法等。

GC法需要將水解的單糖進行乙?；怪茉谏V系統(tǒng)中氣化。然而，由于糖醛酸無法進行乙?；磻?yīng)，因此，無法直接用GC法進行檢測，這時，需要借助強還原試劑（硼氫化鈉等）將糖醛酸還原成中性糖，然后進行乙?；苌?。Wang等[41]通過對多糖的完全酸水解、乙酰化衍生和GC設(shè)置進行條件優(yōu)化，改進了GC分析中性糖和糖醛酸組成的方法。Chen等[42]則建立了基于毛細管氣相色譜的黑靈芝多糖單糖組成分析的方法，該法與HPLC法比較，具有更好的重現(xiàn)性和更低的檢出限。

HPLC法檢測單糖組成同樣需要進行柱前衍生，使單糖分子帶上紫外吸收基團，從而使之可通過紫外檢測器進行檢測，常用的衍生試劑是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）。因糖醛酸可直接被PMP衍生，因此，采用HPLC法測定單糖組成時，不需要進行糖醛酸還原的操作，從而實現(xiàn)中性糖和糖醛酸的同步檢測[43]。HPLC法分析單糖組成的操作相對簡單，具有更好的靈活性，結(jié)合質(zhì)譜檢測器，能有效降低樣品的最低檢出限。

HPAEC結(jié)合脈沖安培檢測器（HPAEC-PAD）是單糖組成分析中最常用的方法之一[44]，其最大優(yōu)點是多糖樣品經(jīng)酸水解后，不需要進行衍生化處理，可直接進樣分析，從而減小試驗誤差。通過調(diào)節(jié)洗脫液的梯度，HPAEC可分離不同種類的中性糖、糖醛酸和寡聚糖等，因此，在多糖的單糖組成分析中應(yīng)用更為廣泛。Zhao等[45]采用HPAECPAD法同步分析了13種單糖和寡糖的混合物；Zhang等[30]則證明HPAEC-PAD法用于分析黑靈芝多糖中的糖醛酸種類時，其結(jié)果比GC法更為可信，能夠直接證明黑靈芝多糖中的糖醛酸為葡萄糖醛酸。

4.3 多糖的甲基化分析

甲基化分析是靈芝多糖結(jié)構(gòu)分析中常用的一種技術(shù)，可用于判斷多糖中糖殘基的連接方式，其反應(yīng)原理如圖4所示。

圖4 β-（1→3，1→6）-葡聚糖的甲基化反應(yīng)過程Fig.4 Methylation procedure of β-（1→3，1→6）-glucan

總之，多糖分子中游離的羥基與甲基化試劑（常用碘甲烷）發(fā)生置換反應(yīng)，游離羥基上的氫被甲基（-CH3）取代；甲基化完全的多糖分子經(jīng)酸水解生成部分甲基化的單糖分子，糖苷鍵連接位點經(jīng)水解后會形成羥基；通過強還原劑將環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單糖打開之后，對部分甲基化的鏈狀單糖分子進行乙?；?，生成部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物（即PMAA）；最后通過GC-MS分析 PMAA，通過 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.htm l）比對，確定糖殘基的連接方式。

甲基化反應(yīng)條件非?？量?，Cui等[40]在Ciucanu和Kerek[46]方法的基礎(chǔ)上，在多糖甲基化方面做了大量的工作，建立了一套完善的甲基化方案。概括其有以下幾個關(guān)鍵點：

1）樣品和試劑需要絕對干燥；

2）用DMSO溶解樣品時要使樣品徹底溶解，若溶解度有限，可加入適量干燥的氫氧化鈉粉末促進溶解，使得游離羥基完全甲基化；

3）甲基化過程盡可能在避光條件下完成，并用氮氣保護反應(yīng)環(huán)境。

酸性多糖中含有一定量的糖醛酸，這會在一定程度上影響多糖甲基化的效果，因此，在甲基化前，需要對酸性多糖進行還原。糖醛酸還原常用的還原劑是硼氫化鈉，Taylor和Conrad[47]探討了硼氫化鈉還原糖醛酸的動力學(xué)過程。而Cui等[40]則認為采用氘代試劑（如硼氘化鈉）作為還原劑，能更方便的用于識別被還原的糖殘基，如Zhang等[30]采用硼氘化鈉還原黑靈芝酸性多糖PSG-1-F0.2，證明PSG-1-F0.2中的糖醛酸連接方式為1→4-葡萄糖醛酸。

不同的PMAA在極性氣相色譜柱中能得到有效的分離，因此，可通過GC串聯(lián)MS檢測器來分析不同的PMAA。在相同填充物的色譜柱中，PMAA的重現(xiàn)性非常的好，可通過文獻的相對保留時間結(jié)合MS信息來推斷糖殘基的連接方式；然而，在不同填充物的色譜柱上，PMAA的出峰時間不同，因此，在比對保留時間時，需要注意文獻數(shù)據(jù)所用的試驗條件。Carpita和Shea[48]總結(jié)了不同PMAA在不同色譜柱中的相對保留時間，可作參考。

PMAA在質(zhì)譜中具有獨特的斷裂方式，在電噴霧離子源（EI源）下具有一定的斷裂規(guī)律：

1）PMAA在質(zhì)譜峰中無分子離子峰，而有一對離子峰的m/z等于這個PMAA的分子質(zhì)量；

2）碎片離子峰主要來自于PMAA分子中的C-C鍵斷裂；

3）兩個帶有甲氧基的C-C鍵最容易發(fā)生斷裂，其次是一個帶甲氧基，一個帶乙酰氧基的C-C鍵，最后是兩個都帶乙酰氧基的C-C鍵；

4）碎片離子峰上的正電荷一般在帶有甲氧基的碳片斷上；

5）碎片離子峰進一步裂分，會按容易程度產(chǎn)生失去 CH3COOH（m/z 60），CH3OH（m/z 32），CH2CO（m/z 42）和HCHO（m/z 30）等二級碎片離子；

6）當(dāng)C-1被氘代標記時，碎片離子峰中，含有C-1的片斷其m/z為偶數(shù)，而不含C-1的離子峰m/z為奇數(shù)，由此，可以判斷異頭碳的位置。

甲基化結(jié)合GC-MS分析是目前分析多糖糖苷鍵連接方式最有效的手段之一，在靈芝多糖的結(jié)構(gòu)解析中被廣泛使用[18，22，27，29-31，49]。

4.4 多糖的NMR波譜分析

NMR技術(shù)在靈芝多糖結(jié)構(gòu)分析中起著非常重要的作用，它可提供異頭構(gòu)型（α或β型）、糖苷鍵連接方式、糖殘基連接順序等信息，是多糖結(jié)構(gòu)解析中最為關(guān)鍵的一個手段。在1D NMR中，1H和13C NMR最常用[50]，多糖在1H NMR中的信號集中于3～6 ppm，很難用于歸屬糖殘基中所有氫的化學(xué)位移；而13C NMR的化學(xué)位移分布就寬很多（60～110 ppm），具有更好的分辨率。多糖的異頭氫出現(xiàn)在4.3～6.0 ppm之間，其中4.3～4.8 ppm為β構(gòu)型，靈芝多糖的異頭氫信號通常出現(xiàn)在這個區(qū)域[18，30]；而 5.0 ppm 以 上為α 構(gòu) 型[31]；3.2～4.5 ppm之間則為H2-H6信號的集中區(qū)域，很難逐一歸屬；一些特征基團可在1H NMR中判斷出來：2.0 ppm附近是乙?；鶊F（CH3COO-）中氫的特征信號，而1.0 ppm附近則為甲基（-CH3）的氫信號[31]。對于13C NMR，95～105 ppm為異頭碳信號，其中β構(gòu)型異頭碳會出現(xiàn)在101 ppm以上，而α構(gòu)型出現(xiàn)在95～103 ppm之間；65～85 ppm區(qū)域為C2-C5的信號集中區(qū)，其中，78～85 ppm是C2-C5中取代位置上的碳信號，65～80 ppm區(qū)域為未被取代的碳信號；61 ppm附近為未被取代的C6信號，而被取代的C6信號則往低場移至69 ppm附近。另外，對于含有糖醛酸或乙酰基的靈芝多糖，其羰基（C=O）中的碳信號會出現(xiàn)在170～180 ppm的低場，這個特征可用于判斷多糖中是否含有羰基化合物[30-31]；甲氧基的碳信號則會出現(xiàn)在55～61 ppm之間，乙酰基中甲基上的碳信號會在22 ppm附近，這些特征信號可用于判斷多糖中的特殊基團。

多糖中相同原子（尤其是C2-C5和H2-H5）的化學(xué)位移差別不大，在1D NMR中會有嚴重的信號重疊，這時，需要借助2D NMR技術(shù)對難以辨認的信號進行歸屬，由此得到多糖分子的結(jié)構(gòu)信息。2D NMR信息是不同糖殘基中C和H化學(xué)位移歸屬和糖連接順序推斷的主要依據(jù)。對于多糖，COSY（Correlation spectroscopy），HSQC（Heteronuclear single quantum coherence）和HMBC（Heteronuclear multiple bond coherence）是解析結(jié)構(gòu)過程中必須獲得的信息[51]。其中，COSY提供的是同一糖環(huán)中相鄰氫原子間的偶合關(guān)系，即H1-H2，H2-H3，H3-H4，H4-H5和H5-H6之間的偶合，偶合常數(shù)越大，峰信號越強。通過糖上容易辨認的氫（如異頭氫或甲基氫），結(jié)合文獻數(shù)據(jù)，可以順利的尋找糖上其它位置的氫信號。HSQC可直接獲得H和與其相連的C之間的1JCH偶合，在COSY基礎(chǔ)上，通過HSQC可以找出糖殘基上每個氫所連接的碳信號。HMBC則可獲得C和H的遠程偶合信號，由此可用于檢測相連兩糖殘基間的C/H偶合，即異頭氫（碳）與另一糖殘基相連位碳（氫）的偶合，從而推斷單糖殘基間的連接片斷[52]。

隨著NMR技術(shù)的發(fā)展，一些新的2D NMR技術(shù)被引入到多糖結(jié)構(gòu)的分析[53]。TOCSY（Total correlation spectroscopy）作為總相關(guān)譜，可檢測糖分子內(nèi)異頭質(zhì)子與沿著碳鏈傳遞下去的的質(zhì)子偶合，即H1-H2→H1-H3→H1-H4→H1-H5→H1-H6，隨著鏈的傳遞，這些信號會越來越弱。TOCSY可以輔助COSY解析屬于該偶合鏈的所有氫信號（主要是重疊比較嚴重的H2-H6信號）。H，HNOESY（Nuclear overhauser effect spectroscopy）是質(zhì)子間空間相互接近產(chǎn)生的一種核交叉馳豫現(xiàn)象。在多糖分子中，糖殘基連接位點的兩個碳上的質(zhì)子空間位置接近，容易產(chǎn)生NOE信號，因此，對糖殘基連接片斷的推斷有很大幫助[54]。

4.5 多糖的分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布

多糖是一種多分散性體系，其分子質(zhì)量并不僅是一個特定的值，還存在一個分布范圍，對于某一特定多糖來說，需要同時給出平均分子質(zhì)量和分子質(zhì)量分布這兩個信息。在高分子化學(xué)中，常用4種統(tǒng)計學(xué)方法來描述高聚物的分子質(zhì)量：數(shù)均分子質(zhì)量（Mn）、重均分子質(zhì)量（Mw）、z-均分子質(zhì)量（Mz）和黏均分子質(zhì)量（Mv）。其中，Mn 可通過膜滲透壓法和分子排阻色譜法來測量得到；Mw可通過靜態(tài)光散射和沉淀平衡法測定，此外，沉淀平衡法還可計算得到Mz；而Mv則需要通過黏度法結(jié)合Mark-Houwink方程計算得到[40，55]。對于某一特定多糖，存在以下關(guān)系：Mz＞Mw＞Mv＞Mn，其中 Mw/Mn的比值稱作多分散性系數(shù)，可以用于描述多糖的分子質(zhì)量分布。對于靈芝多糖，其多分散性系數(shù)通常介于1.0～2.0之間，屬于寬分布的多分散體系[21，56]。

隨著液相色譜技術(shù)的發(fā)展，分子排阻色譜串聯(lián)多檢測器技術(shù)（HPSEC-MALLS）成為多糖分子質(zhì)量分析的最常用方法之一[57]。通過串聯(lián)示差（RI）、激光光散射（LLS）和黏度檢測器（DP）在線同時檢測經(jīng)分子排阻色譜分離的多糖級分，可獲得 Mw、Mw/Mn、Rg和[η]等信息。此外，該方法還可方便的建立Mw與[η]，Mw與Rg和Mw與Rh之間的關(guān)系，從而獲得多糖在溶液中的構(gòu)象特征[58-59]。Liu等[60]采用HPSEC-MALLS法分析了不同種類靈芝中多糖的分子質(zhì)量分布，并建立了靈芝中水溶性β-葡聚糖含量測定的HPSEC法，該法對于靈芝多糖的質(zhì)量控制將起到重要作用。

4.6 多糖的光散射性質(zhì)分析

光散射是多糖溶液構(gòu)象分析的重要工具之一，經(jīng)典光散射技術(shù)主要包括靜態(tài)光散射（SLS）和動態(tài)光散射（DLS）[61]。

靜態(tài)激光光散射是基于Rayleigh散射理論，測定高分子溶液的瞬時光散射強度。物質(zhì)的光散射強度與樣品的濃度（c）和儀器測量角度[P（θ）]有關(guān)，通過測定不同角度和不同濃度樣品溶液的光散射強度，結(jié)合數(shù)學(xué)擬合方法，可檢測高聚物的分子質(zhì)量、分子鏈尺寸和樣品分子與溶劑之間的相互作用等參數(shù)。其中最常用的數(shù)學(xué)擬合方法是Zimm-plot擬合，此外，針對不同物質(zhì)的性質(zhì)，還有Debye、Berry 或 Gunnier等擬合方法[58]。

動態(tài)光散射主要依據(jù)是物質(zhì)的布朗運動。分子在溶液中都進行著劇烈的布朗運動，而小分子的布朗運動比大分子的速率要快很多，這在光散射中所表現(xiàn)的就是弛豫時間的差異，小分子弛豫時間短，大分子弛豫時間長。動態(tài)光散射通過不同弛豫時間通道，可獲得樣品在一定時間內(nèi)的強度時間相關(guān)函數(shù)（TCF），該函數(shù)與樣品平移擴散系數(shù)（＜D＞）有關(guān)，因此，通過對TCF進行數(shù)學(xué)擬合，可直接獲得樣品的＜D＞，并由此通過Stokes-Einstein方程計算樣品的平均流體力學(xué)半徑Rh[58，62]。

經(jīng)典光散射由于對溶劑沒有限制，在高分子構(gòu)象分析中具有廣泛的應(yīng)用。結(jié)合靜態(tài)和動態(tài)光散射數(shù)據(jù)，可獲得物質(zhì)在稀溶液中的Mw、Rg、第二維里系數(shù)A2、＜D＞和Rh等構(gòu)象參數(shù)，由此計算高聚物的結(jié)構(gòu)參數(shù)ρ（R g/Rh），ρ值是高分子鏈在溶液中的一個特性參數(shù)，能表征高分子鏈在溶液中的構(gòu)象特征：在良溶劑中，當(dāng)ρ=0.77時，為硬球構(gòu)象；隨著ρ的增大，緊湊的高分子鏈逐漸展開，柔性增強；當(dāng)ρ=1.5～1.8時，則為線性柔順鏈；而ρ接近2時，多分散體系為無規(guī)線團或高支化的無規(guī)結(jié)構(gòu)；當(dāng)ρ遠遠大于2時，多分散體系則為剛性棒狀結(jié)構(gòu)[61]。Liu等[13]采用經(jīng)典光散射分析了靈芝多糖GLP20在不同溶劑中的性質(zhì)，結(jié)果表明GLP20在DMSO中的分子質(zhì)量是在水溶液中的1/3，結(jié)構(gòu)參數(shù)ρ值表明GLP20在水溶液中呈剛性鏈狀結(jié)構(gòu)，而在DMSO中為無規(guī)線團，由此推測GLP20在水溶液中存在3股螺旋的剛性結(jié)構(gòu)，而DMSO可以破壞3股螺旋結(jié)構(gòu)，使GLP20分子鏈展開形成無規(guī)線團。

4.7 原子力顯微鏡

原子力顯微鏡（AFM）是近年來發(fā)展起來的觀察生物大分子構(gòu)象和形貌的有力工具[63-64]。AFM的操作平臺有兩種成像模式：接觸模式和輕敲模式；其工作原理是通過附在一根可活動的微懸臂底端的細小探針來掃描樣品，當(dāng)探針與樣品表面有接觸時，極微小的作用力即可引起微懸臂的偏轉(zhuǎn)，由此產(chǎn)生相關(guān)信號，最后通過光電檢測系統(tǒng)對該信號進行檢測、放大和轉(zhuǎn)換，得到樣品的地形圖、相位圖、高度圖等圖像。AFM不同的成像模式對樣品具有一定的適用性。接觸模式可得到樣品的連續(xù)結(jié)構(gòu)信號，然而，探針尖端一直與樣品表面接觸，容易引起樣品的漂移或損壞，也容易破壞探針，因此該模式更適用于剛性高分子；而輕敲模式采用高頻振動的探針來掃描樣品，可控制探針與樣品的表面距離，保持振動頻率恒定的同時不會破壞樣品的表面，因此，輕敲模式對于柔性的生物大分子物質(zhì)非常重要[65]。

AFM可在接近生理環(huán)境的條件下對生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA和多糖等進行形貌掃描。Mcintire等[66]用AFM觀察了裂褶菌葡聚糖和硬葡聚糖的三螺旋結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該三螺旋鏈可通過加熱處理解聚形成單股無規(guī)線團；Paniagua等[67]則通過AFM技術(shù)觀察到草莓果膠是一種線型長鏈的復(fù)合物，并存在RGII二聚體，而通過酶解和酸處理，可減小復(fù)合物的大小，清除二聚體的形成。由于大部分靈芝多糖的分子都較小，很難通過AFM觀察到靈芝多糖的單分子鏈，然而隨著AFM技術(shù)的不斷發(fā)展，其在靈芝多糖鏈結(jié)構(gòu)的分析中將扮演重要角色。

5 展望

經(jīng)過近幾十年的發(fā)展，隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的飛速進步，靈芝多糖結(jié)構(gòu)的研究取得了很大突破。已報道從不同靈芝品種中提取分離得到的靈芝多糖有200多種，其呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)多樣性、分子質(zhì)量分布寬等特點。然而，由于靈芝多糖組成復(fù)雜，難以分離純化得到均一的成分，因此對其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的分析還存在很大挑戰(zhàn)。隨著分析技術(shù)的發(fā)展，包括高頻NMR（900MHz及以上）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）、單分子原子力顯微鏡技術(shù)、冷凍電鏡、分子模擬等技術(shù)在靈芝多糖中應(yīng)用，將有助于獲得更多關(guān)于多糖鏈結(jié)構(gòu)的信息。基于這些技術(shù)構(gòu)建靈芝多糖的結(jié)構(gòu)庫，將極大促進靈芝多糖構(gòu)效關(guān)系的構(gòu)建，并將對靈芝多糖發(fā)揮生物活性的內(nèi)在作用機制和通路的闡明提供理論基礎(chǔ)。