鱖魚下腳料酶解物對冷凍鱖魚的保水作用

黃 瓊 方旭波* 李 瑩 周劍忠 陳小娥 夏偉榮

（1 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院 浙江舟山 316022

2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京 210014）

鱖魚又名桂花魚，在分類學(xué)上屬于硬骨魚類（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes），魚旨科（Serranidae），鱖亞科（Sinipercinae），鱖魚屬（Siniperca Gill）[1]。鱖魚以肉質(zhì)細(xì)嫩豐滿，肥厚鮮美，營養(yǎng)豐富，內(nèi)部無膽，少刺而著名，是一種名貴的淡水魚類[2]。鱖魚季節(jié)性強(qiáng)，大多以鮮活銷售，一旦滯銷，將造成極大的浪費(fèi)。冷凍保藏可最大限度地保持鱖魚的營養(yǎng)價值和風(fēng)味品質(zhì)，然而在凍藏過程中產(chǎn)生的冰晶，易使鱖魚肌肉細(xì)胞受損，蛋白質(zhì)變性，增加解凍時的汁液流失，導(dǎo)致其風(fēng)味和營養(yǎng)價值下降[3]。

傳統(tǒng)保水劑多采用復(fù)合磷酸鹽保持產(chǎn)品嫩度，然而由于磷酸鹽易被水解，影響保水效果，因此一些不良商家違規(guī)操作，常過量添加磷酸鹽[4]，影響產(chǎn)品的品質(zhì)甚至影響消費(fèi)者健康，導(dǎo)致消費(fèi)者機(jī)體鈣磷比例失衡（即影響機(jī)體鈣磷代謝）[5]，而鈣磷代謝平衡被打破后會造成佝僂病、骨質(zhì)疏松等代謝性骨病。因此，開發(fā)新型無磷保水劑，避免磷酸鹽過量添加導(dǎo)致人體健康損害的研究，具有重要現(xiàn)實意義[6]。

目前，國內(nèi)外對于新型無磷保水劑的研究已有報道[7-8]，主要為卡拉膠寡糖[9]、海藻糖[10]、變性淀粉[11]、大豆蛋白[12]等。利用水產(chǎn)品加工廢棄物酶法獲得磷酸鹽替代物作為保水劑，不僅使廢棄物得到充分利用，而且方法綠色安全。Shanidi等[13]將肉糜混合一種蛋白酶解物后加熱，發(fā)現(xiàn)蒸煮損失率在一定程度上降低，產(chǎn)品的保水性也得以改善，原因可能是蛋白酶解物中豐富的游離氨基酸可使肉類的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而達(dá)到保水的效果；Mohammed等[14]發(fā)現(xiàn)蛋白水解物（FPH）可以通過提高Ca2+-ATPase活性、凝膠強(qiáng)度等方面延緩魚肉蛋白質(zhì)變性程度。

本試驗以鱖魚魚肉為研究對象，利用低場核磁共振分析儀、質(zhì)構(gòu)儀、掃描電鏡分別測定鱖魚魚肉經(jīng)不同保水劑處理凍藏后的水分狀態(tài)、組織特性以及微觀結(jié)構(gòu)，評價鱖魚下腳料酶解物對鱖魚的保水效果，以期減少冷凍鱖魚的汁液流失，保障產(chǎn)品品質(zhì)，既實現(xiàn)了加工副產(chǎn)物的再利用，也為冷凍水產(chǎn)品新型保水劑的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱖魚，南京嘉鴻水產(chǎn)商行，均重（500±50）g。將鮮活鱖魚置于含冰的泡沫箱內(nèi)，30min內(nèi)運(yùn)回實驗室。

中性蛋白酶（1×106U/g），上海源葉生物科技有限公司；三聚磷酸鹽，河南思遠(yuǎn)生物科技有限公司；食鹽，市售食品級；2.5%戊二醛、無水乙醇等所有試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫試驗箱（DW-150），南京泰斯特試驗設(shè)備；醫(yī)用低溫保存箱（DW-4 OL 278），海爾；紫外分光光度計（UV-1600 PC），上海美譜達(dá)；勻質(zhì)分散機(jī)（T 25），德國IKA公司；高速離心機(jī)（3 K15），德國Sigma公司；質(zhì)構(gòu)儀（TVT-300 XP），美國FTC公司；低場核磁共振儀（PQ001），上海紐邁；掃描電子顯微鏡（EVO-LS 10），德國卡爾蔡司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測定 采用雙縮脲法（Biuret法）[15]測定蛋白質(zhì)濃度。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=0.05x-0.0033，R2=0.9992。

1.3.2 原料預(yù)處理 將鱖魚魚鰾和鱖魚魚皮、魚骨分別洗凈后剪成小塊干燥，備用。將原料浸入5%食鹽溶液中攪拌24 h，料液比1∶10，期間更換1次浸泡液，離心，用蒸餾水清洗沉淀8～10次。在沖洗后的鱖魚魚鰾和鱖魚魚皮、魚骨中加入去離子水使料液比為1∶8，在85℃水浴中恒溫浸提6 h，4 000 r/min離心10min，取上清液即為酶解底物，待用。

1.3.3 鱖魚副產(chǎn)物蛋白酶解液的制備[16]將上述鱖魚魚鰾和魚皮魚骨浸提液預(yù)熱至37℃，調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入一定量中性蛋白酶進(jìn)行酶解。待酶解結(jié)束后，于95℃水浴中滅酶10min，冷卻后3 000 r/min離心10min，取上清液。將酶解液減壓濃縮，并用雙縮脲法測定蛋白濃度[15]，統(tǒng)一蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為83.34mg/mL。

1.3.4 浸漬液處理設(shè)計 浸漬液設(shè)計見表1。在低溫條件下，將新鮮鱖魚去頭、去骨、去皮，用鋒利小刀切成40mm3大小，洗凈瀝干并用紗布拭干水分，給各組鱖魚魚肉編號后稱量并記為A1（精確至0.001 g，下同），將上述浸漬液預(yù)冷至0℃，在4℃浸泡2 h每隔20min攪拌1次，再次瀝干并用紗布拭干水分，稱質(zhì)量記為A2。將浸泡稱重后的鱖魚移至低溫試驗箱速凍至中心溫度-40℃后，迅速置于-40℃冰箱中，每隔24 h反復(fù)凍融1次，反復(fù)凍融2次后測定各指標(biāo)。

表1 不同浸漬液對鱖魚魚肉的處理設(shè)計Table1 Treatment design of different maceration extract on mandarin fish

1.3.5 浸泡增重率、解凍損失率、蒸煮損失率的測定 選擇鱖魚背部肌肉作為試驗對象，10℃條件下，以料液比1∶2，浸泡2 h后，瀝水，稱重，計算樣品的浸泡增重率[17]。設(shè)置3個平行，結(jié)果取平均值。按下式計算浸泡增重率：

式中，A2——魚肉浸泡后的質(zhì)量，g；A1——魚肉原始質(zhì)量，g。

解凍損失率測定：取出凍藏的魚肉置于室溫下自然解凍2 h，瀝水，稱重。按下式計算解凍損失率：

式中，A2——魚肉浸泡后的質(zhì)量，g；A1——魚肉解凍后的質(zhì)量，g。

蒸煮損失率的測定：將測定解凍損失率后的樣品，于沸水中蒸煮10min，冷卻至室溫后瀝水，稱重。按下式計算蒸煮損失率[17]：

式中，A1——魚肉蒸煮前的質(zhì)量，g；A2——魚肉蒸煮后的質(zhì)量，g。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性的測定 根據(jù)Tolasa等[18]的方法使用質(zhì)構(gòu)分析儀測定硬度、彈性和咀嚼性。樣品處理：挑選鱖魚背部肌肉，調(diào)整魚肉大小至20mm3，室溫下靜止30min，p/30平底柱形探頭，探頭下降速率 3mm/s，測試速率1mm/s，返回速率 1mm/s，樣品壓縮形變量50%。

1.3.7 肌肉中水分的分布與組成測定 采用低場核磁共振分析儀測定冷凍鱖魚肌肉水分分布，試驗方法參考Sánchez等[19]略有改動。取質(zhì)量約2.5 g的樣品放入核磁測定管內(nèi)，設(shè)置參數(shù)：半回波時間為100μs，掃描次數(shù)為8次，重復(fù)時間為3 000 ms，利用核磁共振時間反演擬合軟件得到關(guān)于T2的圖像。

1.3.8 掃描電鏡分析[20]樣品室溫化凍后，調(diào)整其大小至1mm3，浸沒于2.5%戊二醛溶液中，并置于4℃冰箱內(nèi)固定3 h以上，隨后用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次15min。將樣品在30%，50%，70%，80%，90%梯度體積分?jǐn)?shù)的酒精中依次脫水，每個梯度放置15min，脫水完畢后，使用無水乙醇脫水3次，每次30min。將脫水后的樣品放入叔丁醇中置換2 h或更長時間，置于冷凍干燥儀中進(jìn)行干燥以脫去樣品中剩余的水分。樣品噴金后，通過掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次取平均值，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保水劑對冷凍鱖魚魚肉保水性的影響

表2從浸重率、解凍損失率、蒸煮損失率反映了試驗中不同保水劑處理對鱖魚保水性的影響。經(jīng)過保水劑浸泡后，鱖魚魚肉質(zhì)量均在不同程度上增加?？瞻捉M（蒸餾水）處理的樣品浸重率為1.38%，4%STPP處理組浸重率為6.03%，鱖魚魚鰾酶解液處理組和鱖魚魚皮魚骨酶解液處理組差異不顯著（P＞0.05）。鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽復(fù)配組顯著優(yōu)于單一的食鹽組，與4%STPP組差異不顯著（P＜0.05），這說明鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽復(fù)配處理鱖魚保水效果顯著。

在凍藏期間，肌肉細(xì)胞內(nèi)水分流失主要是因為其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，肌肉細(xì)胞中生成的冰晶會使蛋白質(zhì)擠壓聚集。蒸餾水（空白組）處理后解凍損失率為14.30%，各保水劑處理組的解凍損失率均小于單一食鹽處理組。4%STPP處理的鱖魚魚肉解凍損失率最小，與鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽處理組差異不顯著。

魚肉保水性能的優(yōu)劣也可以用蒸煮損失率衡量，蒸煮損失率較低，保水性較好。蒸煮后，鱖魚魚肉的蒸煮損失率約為5%～15%，保水劑處理后的樣品具有較低的蒸煮損失率，可以看出保水劑處理魚肉可以使蒸煮損失率降低，從而達(dá)到保水的效果。4%STPP處理的樣品組具有最低的蒸煮損失率，因為STPP處理后，肌原纖維蛋白被劇烈破壞，肌球蛋白從肌原纖維所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中脫離，可溶性蛋白質(zhì)含量增加。在加熱過程中，肌肉中的水因肌球蛋白凝膠的形成而被固定[21]。鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽復(fù)配組處理的樣品效果顯著，與 4%STPP處理效果差異不顯著（P＞0.05），說明鱖魚魚鰾酶解液與食鹽協(xié)同與蛋白質(zhì)作用，對減少魚肉水分的散失具有積極作用。

2.2 質(zhì)構(gòu)分析

由表3可以看出，經(jīng)過兩次反復(fù)凍融后鱖魚魚肉硬度、彈性、咀嚼性均有所下降，質(zhì)構(gòu)特性惡化。在貯藏期間，肌肉組織被破壞可能是由于蛋白質(zhì)被擠壓變性，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在解凍過程中汁液的流失也會導(dǎo)致鱖魚魚肉硬度、彈性及咀嚼性下降。彈性下降也與魚體死后的自身降解和微生物分解有關(guān)[22]。各保水劑浸泡處理組的鱖魚魚肉彈性均顯著優(yōu)于蒸餾水（空白）組（P＜0.05）。其中魚鰾酶解液+2.5%食鹽復(fù)配浸泡處理組的彈性值為0.453，與 4%STPP組無顯著差異（P＞0.05），與新鮮組差異最小。另外，經(jīng)過兩次反復(fù)凍融后，鱖魚肌肉的組織結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致咀嚼性下降。保水劑處理組的鱖魚咀嚼性均顯著優(yōu)于蒸餾水（空白）組，其中以鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽復(fù)配浸泡處理效果最佳，與4%STPP處理組差異不顯著（P＞0.05），說明鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽復(fù)配浸泡處理鱖魚魚肉凍藏后水分流失較少，細(xì)胞間空隙小，水分結(jié)合力較大。本試驗中，魚鰾酶解液+2.5%食鹽復(fù)配處理鱖魚在一定程度上緩解了肌肉蛋白質(zhì)的冷凍變性，進(jìn)而減緩了鱖魚魚肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的下降程度。

表2 不同保水劑對冷凍鱖魚肉保水性的影響Table2 Effect of weight gain，cooking loss，and cooking yield with various treatments of freeing mandarin fish

表3 不同保水劑處理的冷凍鱖魚肉硬度、彈性、咀嚼性的變化Table3 Hardness，springiness and chewiness of freezing mandarin fish with various treatments

2.3 低場核磁分析

低場核磁共振橫向弛豫時間T2可作為衡量肉類結(jié)構(gòu)持水能力的指標(biāo)[23]。利用硬脈沖CPMG序列測定樣品的自旋-自旋弛豫時間T2。魚肉中的水分含量為70%～80%，這些水分有3種存在形式，即結(jié)合水T21，可移動水T22及自由水T23[24]。水產(chǎn)品的食用品質(zhì)主要取決于肌肉細(xì)胞對可移動水的持有能力，這部分水分約占水分總量的80%左右[25]，對魚肉的結(jié)構(gòu)、外觀和感官有很大影響?？梢苿铀甌22積分面積與肌纖維結(jié)構(gòu)中截留的水分呈正相關(guān)，面積越大，水分越多，產(chǎn)品的保水性更好。

如圖1所示，保水劑處理的樣品組可移動水T22積分面積顯著高于空白處理組，說明添加保水劑可以有效控制魚肉肌纖維中可移動水含量的減少，顯著提高鱖魚魚肉的保水性（P＜0.05）。鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽處理組樣品組T22積分面積顯著高于4%STPP組（P＜0.05），說明鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽處理鱖魚魚肉可有效提高其保水性。鱖魚魚鰾酶解液處理組和鱖魚魚皮、魚骨酶解液處理組與2.5%食鹽處理組的積分面積差異不顯著（P＞0.05）。從圖2可以看出，鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽處理組的核磁共振譜圖與空白及單一食

圖1 不同保水劑處理的冷凍鱖魚可移動水（T22）的峰面積Fig.1 The peak area integration（T22） of freezing mandarin fish with different treatments

2.4 電鏡分析

魚的肌肉組織主要由肌細(xì)胞構(gòu)成，肌細(xì)胞又稱肌纖維，常以單根、成束或成層排列[26]。新鮮魚肉的肌纖維其掃描電鏡成像排列有序，結(jié)構(gòu)清晰的。

不同保水劑浸泡處理對鱖魚肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)的影響，見圖3和圖4。新鮮鱖魚肌肉（圖3a和圖4a）內(nèi)部肌肉組織排列整齊，彼此間結(jié)合緊密。蒸餾水處理組（圖3b和4b），鱖魚肌肉組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，肌束細(xì)胞破壞嚴(yán)重，紋理模糊，肌束間的間隙變大，出現(xiàn)許多大孔洞，這可能是由于凍藏過程中形成的冰晶破壞了肌肉組織細(xì)胞，加劇了凍藏過程中蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致肌束間的孔間距增大。2.5%食鹽處理組（圖3c和4c），鱖魚肌肉組織間產(chǎn)生了許多空隙，肌束發(fā)生撕裂，肌肉細(xì)胞被破壞，孔洞面積較大。4%STPP處理組（圖3d和4d），鱖魚肌束間產(chǎn)生了較多空隙，然而其肌肉纖維排列仍較緊密，孔洞直徑較蒸餾水處理組小。鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽處理組（圖3e和4e），鹽組圖譜相比，發(fā)生左移，說明添加鱖魚魚鰾酶解液和2.5%食鹽復(fù)配處理的鱖魚魚肉保水性發(fā)生顯著性變化，弛豫時間縮短，魚肉肌纖維中可移動水的水分流動性減弱。進(jìn)而證明，鱖魚魚鰾酶解液與2.5%食鹽協(xié)同使用可以有效提高鱖魚魚肉的保水性。鱖魚肌肉排列仍較緊密，完整性好，肌束細(xì)胞未見明顯撕裂，肌束間空隙較小，與新鮮鱖魚肌肉組織較為接近。這可能是因為鱖魚魚鰾酶解液中富含蛋白質(zhì)酶解所產(chǎn)生的游離氨基酸、長鏈多肽、短肽等釋放出較多數(shù)量可與肌肉蛋白質(zhì)親水結(jié)合的官能團(tuán)如羧基、羥基等，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，進(jìn)而提高肌肉的保水性[27]，抑制了蛋白質(zhì)變性。而食鹽有助于蛋白質(zhì)結(jié)合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)保護(hù)層，可束縛更多的水分[28]。

圖2 不同保水劑處理的冷凍鱖魚的弛豫時間T2Fig.2 Relaxation time T2 of various kinds of freezing mandarin fish with different treatments

3 結(jié)論

在凍藏過程中，不添加保水劑的水產(chǎn)品品質(zhì)下降嚴(yán)重，而添加傳統(tǒng)商業(yè)保水劑如磷酸鹽等，若添加過量會影響消費(fèi)者健康。本研究發(fā)現(xiàn)，鱖魚加工副產(chǎn)物的酶解產(chǎn)物能作為冷藏鱖魚魚肉的有效保水劑。鱖魚魚鰾酶解液+2.5%食鹽浸泡處理能有效降低鱖魚的汁液損失，在保持冷凍鱖魚硬度、彈性和咀嚼性方面具有較好的效果，減弱了魚肉中水分的整體流動性，微觀結(jié)構(gòu)顯示，處理后的冷凍鱖魚肌纖維變化較小，對冷凍損傷具有良好的保護(hù)作用。鱖魚魚鰾通常為加工副產(chǎn)物，大多被廢棄，既浪費(fèi)資源，還會造成環(huán)境污染。本研究利用名貴鱖魚的加工副產(chǎn)物魚鰾進(jìn)行品質(zhì)提升研究，取之于魚，用之于魚，既實現(xiàn)了副產(chǎn)物的高值利用又減輕了環(huán)境壓力，為魚鰾等副產(chǎn)物的再利用提供了一條有效途徑，也為開發(fā)新型無磷保水劑提供了理論依據(jù)。

圖3 不同保水劑處理的鱖魚肌肉結(jié)構(gòu)（縱切）Fig.3 SEM micrographs of mandarin fish（longitudinal cross sections）

圖4 不同保水劑處理的鱖魚肌肉結(jié)構(gòu)（橫切）Fig.4 SEM micrographs of mandarin fish（transverse cross sections）