microRNA對干細胞調(diào)控作用的研究進展

張念平 劉浩 龍大宏

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250011；2廣州醫(yī)科大學(xué)；3濟南市第三人民醫(yī)院)

核糖核酸(RNA)，是廣泛存在于生物體內(nèi)的重要遺傳信息載體。其中，能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子稱為編碼RNA，也稱信使RNA(mRNA)，不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子稱非編碼RNA(ncRNA)。微小RNA(miRNA)是ncRNA的一種，于1993年首次在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)〔1〕。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)microRNA在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，它廣泛參與細胞間信號傳導(dǎo)及參與細胞代謝、生長、增殖、分化、凋亡等多方面的生物進程。當(dāng)microRNA調(diào)控功能發(fā)生障礙，可能導(dǎo)致一些基因的異常表達〔2〕。

干細胞是一類具有自我更新能力和分化潛能的細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能的細胞。干細胞對重建或修復(fù)衰老病變的組織器官方面有著巨大的潛力，細胞替代治療已成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究熱點之一。然而，干細胞的分化過程十分復(fù)雜，受多種誘導(dǎo)因子和細胞信號通路的調(diào)控，具體分化機制仍然不清楚。在干細胞分化過程中細胞多種miroRNA含量有著劇烈的變化，其含量或上調(diào)或下調(diào)〔3,4〕。另外有研究發(fā)現(xiàn)，人為干預(yù)microRNA的表達也能顯著影響干細胞的分化。這提示干細胞的分化過程受microRNA的調(diào)控〔5,6〕。本文就microRNA對干細胞的調(diào)控作用進行綜述。

1 microRNA的命名規(guī)則

microRNA數(shù)量眾多，為了便于閱讀文獻，有必要在此簡單介紹microRNA的命名規(guī)則。除了最早發(fā)現(xiàn)的let-7和lin-4以外，其他成熟microRNA現(xiàn)在都用“miR-#”來表示，而相對應(yīng)的編碼基因則用“mir-#”或“MIR-#”表示〔7〕。#代表數(shù)字，表示microRNA發(fā)現(xiàn)的先后順序。一般在mir-#前面加三個字母的前綴來區(qū)分物種來源，然而有些文獻描述microRNA時也常常忽略此前綴。如：hsa(Homo sapiens)表示人類，mmu(Mus musculus)表示小鼠，hsa-miR-101，代表人miR-101。高度同源的microRNA在命名時常于數(shù)字后面加一個小寫英文字母進行區(qū)分，例如mmu-miR-10a和mmu-miR-10b。位于不同位點而編碼相同的microRNA基因，在后面加一個數(shù)字后綴進行區(qū)分，例如hsa-miR-521-1和hsa-miR-521-2。如果從同一個前體的2個臂分別加工產(chǎn)生microRNA，一般根據(jù)克隆試驗已知相對表達量，以“*”號表示表達量相對較低的microRNA，比如hsa-miR-520d和hsa-miR-520d*。當(dāng)不能區(qū)分表達量多少時，則采用后綴標(biāo)注其起源的發(fā)夾臂端，例如mmu-miR-292-3p表示起源于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3′端，而mmu-miR-292-5p代表來源于5′端〔8〕。

2 microRNA的特征

microRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在真核生物中廣泛存在，其本身不具有開放閱讀框，一般不能編碼蛋白質(zhì)。microRNA通常的長度一般為22個核苷酸左右，但在3' 端因有poly A 尾的結(jié)構(gòu)，因此長度上可有1～2 個堿基的變化，可通過Northern印跡檢測到。成熟microRNA 的5'端有單一磷酸基團，而3'端則為羥基，這是與相同長度的功能RNA降解片段區(qū)分的標(biāo)志。microRNA能以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在，而都以成簇排列為主，其基因經(jīng)常協(xié)同表達。microRNA具有明顯的特異性，即microRNA的表達譜和序列特征在不同的組織和不同的細胞中表達不同。這些microRNA可能可以作為細胞或組織的特異性標(biāo)志物。處于不同發(fā)育階段的細胞microRNA組成不同，在特定發(fā)育階段的細胞會出現(xiàn)特定的microRNA，這決定細胞的分化方向及分化時相，同時也表明microRNA的表達具有一定的時序性。microRNA的表達及作用都具有高度的保守性，在不同種屬、不同組織及不同細胞中，相同或相似的microRNA 分子具有相似的調(diào)控功能〔9〕。microRNA作用具有多靶點性(網(wǎng)絡(luò)性)特點，即在生物體內(nèi)一個microRNA可以作用于多個靶mRNA，而單個靶mRNA也可以同時受多個microRNA調(diào)控。因此microRNA的調(diào)控作用很可能是一種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，它需要接受某些信號的刺激，從整體上調(diào)控有機體。

3 microRNA的形成過程和作用機制

在哺乳動物中，細胞核內(nèi)編碼microRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物microRNA前體(pri-microRNA)，進而在細胞核內(nèi)被RNaseⅢ核酸內(nèi)切酶Drosha和其調(diào)節(jié)亞基DGCR8蛋白組成的復(fù)合物加工成長約70～100個核苷酸的pre-microRNA〔10〕。然后pre-microRNA被RAN蛋白-三磷酸鳥苷結(jié)合物(RAN-GTP)和exportin 5轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)內(nèi)，在核酸酶Dicer的作用下，剪切形成microRNA:microRNA*雙鏈配對結(jié)構(gòu)。此雙鏈結(jié)構(gòu)在解旋酶的作用下解鏈，其中一條鏈被降解，另一條為成熟的單鏈microRNA(多為具有5'端小突起的一條鏈)。成熟的microRNA與Argonaute蛋白(AGO1)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)〔11〕。進而通過microRNA 5'端與靶mRNAs 的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)特異性的堿基配對，降解mRNA或阻遏mRNA的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白的表達。

RISC對目的mRNA的作用機制主要有三種。當(dāng)microRNA與靶mRNA不完全互補結(jié)合時，可以抑制靶mRNA的翻譯但不影響其穩(wěn)定性，此種方式在動物中多見，如線蟲lin-4。當(dāng)microRNA與靶mRNA完全互補結(jié)合時，靶mRNA最終降解，此種方式常出現(xiàn)于植物中，如擬南芥miR-171。第三種作用方式包含了以上兩種作用機制，當(dāng)microRNA與靶mRNA完全互補結(jié)合時，可直接靶向切割mRNA，如HeLa細胞和果蠅中的let-7可直接介導(dǎo)RISC分裂切割靶mRNA。當(dāng)microRNA與靶mRNA不完全互補結(jié)合時，可起到調(diào)節(jié)基因表達的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA的3'UTR不完全互補結(jié)合后，可抑制基因翻譯〔12〕。由于microRNA可以結(jié)合到靶mRNAs的3'UTR來發(fā)揮調(diào)控作用，因此一個microRNA可以有上百個靶mRNA，而一個靶mRNA也可能被多個microRNA調(diào)控。據(jù)估計，microRNA調(diào)控超過60%的蛋白編碼基因〔13〕。

4 microRNA對干細胞的調(diào)控作用

目前已經(jīng)從哺乳動物中發(fā)現(xiàn)數(shù)百個microRNA，其中一些microRNA與干細胞類型相關(guān)，其在細胞內(nèi)的含量隨干細胞的分化而發(fā)生改變。通過研究microRNA在干細胞中的作用，可進一步揭示干細胞增殖及分化過程的內(nèi)在機制。

胚胎干細胞(ESCs)具有無限的自我更新能力及分化成其他類型細胞的能力，研究發(fā)現(xiàn)microRNA與ESCs自我更新和分化方面有密切的關(guān)系。在未分化的ESCs中，僅有少數(shù)幾種microRNA高度表達：在鼠ESCs中為miR-292 和miR-302 家族；在人ESCs中為miR-371 和miR-302 家族〔1〕，這些microRNA可能在維持ESCs的特性方面發(fā)揮作用。另外有些microRNA對ESCs的分化起促進作用，如miR-1和miR-133 可促進ESCs向中胚層方向分化，miR-9可促進ESCs向神經(jīng)細胞方向分化。miR-9通過抑制核受體核受體無尾蛋白(TLX)對神經(jīng)干細胞的增殖進行負調(diào)控，并促進神經(jīng)干細胞的分化。而當(dāng)表達缺少miR-9識別位點的TLX時，可以挽救miR-9所引起的細胞增殖障礙，并能抑制神經(jīng)干細胞的分化。這提示miR-9和核受體TLX形成了一個負調(diào)節(jié)環(huán)路，維持神經(jīng)干細胞的增殖和分化的平衡〔14〕。此外miR-9對神經(jīng)祖細胞的增殖、遷移也有著調(diào)節(jié)作用。人ESCs分化為神經(jīng)祖細胞時，其細胞內(nèi)的miR-9表達被激活，同時miR-9也能促進神經(jīng)祖細胞的增殖，在神經(jīng)祖細胞分化為神經(jīng)細胞后，miR-9仍然持續(xù)表達。體外實驗中miR-9的減少可以抑制神經(jīng)祖細胞的增殖，但卻能促進神經(jīng)祖細胞的遷移。當(dāng)把無miR-9活性的神經(jīng)祖細胞移植入胚鼠腦內(nèi)或腦卒中模型的成年小鼠腦內(nèi)，這些細胞仍然顯示出較強的遷移能力。然而，盡管miR-9是完全保守的序列，但它在不同的生物體內(nèi)表達的模式和功能有著顯著的不同〔15〕。另外，microRNA在ESCs的細胞周期調(diào)控中起重要作用。ESCs細胞周期的特點是G1期很短，干細胞能很快進入S期。而Dicer酶突變的ESCs表現(xiàn)出明顯的增殖缺陷，處于G0期和G1期的細胞小幅度增多。狄喬治綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因(DGCR)8敲除的ESCs多停滯在G1期，雖然形態(tài)上看起來正常，也表達ESCs的特異性標(biāo)志物，但細胞倍增時間延長〔16〕。

誘導(dǎo)多能干細胞(iPSCs)是在形態(tài)、基因和蛋白表達、細胞增殖能力、分化能力等方面都與ESCs相似的一類細胞。將四種轉(zhuǎn)錄因子基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)以病毒載體導(dǎo)入已分化的體細胞中，使細胞重新編程，可以得到具有多向分化潛能的iPSCs。然而這種方式誘導(dǎo)效率較低，近幾年有研究嘗試使用microRNA與轉(zhuǎn)錄因子共同誘導(dǎo)體細胞重編程，取得了較好的效果。在使用三個外源性轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Klf4、Oct4的同時，過表達兩個microRNA家族：miR-106a-363及miR-302-367，可以有效提高小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)為iPSCs的效率〔17〕。除此以外，有些microRNA對iPSCs的定向分化也有促進作用。Lahmy等〔18〕報道使用人包皮成纖維細胞重編程為iPSCs，在沒有其他誘導(dǎo)因子的情況下，以慢病毒為載體將miR-375在iPSCs中過表達，通過形態(tài)學(xué)評估、免疫細胞化學(xué)、胰島標(biāo)志基因表達分析發(fā)現(xiàn)，從過表達miR-375的iPSCs中可以得到胰島素樣細胞，而且這些胰島素樣細胞還能分泌胰島素。塞特1基因(Sirt1)是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白脫乙酰酶，與細胞的增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關(guān)。miR-34a是第一個被發(fā)現(xiàn)對Sirt1有調(diào)控作用的microRNA。miR-34a可以通過結(jié)合在Sirt1 mRNA的3′UTR上，從而減少Sirt1的表達。研究發(fā)現(xiàn)Sirt1對iPSCs向神經(jīng)干細胞起負調(diào)控作用，即抑制iPSCs向神經(jīng)干細胞分化，并且這一過程可能被miR-34a調(diào)控。當(dāng)Sirt1表達下降時，miR-34a表達反而升高。當(dāng)抑制Sirt1時，能增強iPSCs向神經(jīng)干細胞的分化并促進成熟神經(jīng)細胞的形成。因此在iPSCs分化過程中，通過miR-34a對Sirt1 mRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用，可以抑制Sirt1的表達，這樣可以獲得更多的神經(jīng)干細胞和神經(jīng)細胞〔19〕。

miR-122是第一個被鑒定的肝特異性microRNA分子，它在肝臟中高度表達，其表達量約占肝臟中所有microRNA的70%，而在其他組織器官中表達很低甚至檢測不到。它在肝臟胚胎發(fā)育、肝細胞生長及表型維持、應(yīng)激反應(yīng)、病毒感染、膽固醇與脂肪酸代謝等多種生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。有研究通過攜帶miR-122的重組腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染ESCs源性肝前體細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-122后細胞肝特異性基因如ALB、TTR、AAT、G-6-P、CK8、CYP7A1和CYP3A4的mRNA表達水平明顯升高。這表明轉(zhuǎn)染miR-122后，細胞在功能學(xué)上接近成熟肝細胞水平，miR-122能有效地促進小鼠ESCs源性肝前體細胞的分化和成熟〔20〕。miR-199a-5p是另外一種在ESCs向干細胞分化過程中起作用的microRNA，它在肝樣細胞中表達最高，其次是胎肝，成熟肝細胞中含量最少，幾乎檢測不到。miR-199a-5p對小鼠和人的ESCs分化起負調(diào)節(jié)作用，抑制miR-199a-5p能增強小鼠和人的ESCs向肝細胞分化。SMARCA4和MST1是miR-199a-5p的靶基因，在肝臟再生過程中能增加肝細胞的生成。降低miR-199a-5p的表達，導(dǎo)致SMARCA4和MST1表達上調(diào)，從而促使胚肝發(fā)育時期肝細胞形成〔21〕。

microRNA對造血過程也有調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)原始造血祖細胞多能性的維持和造血過程早期和晚期階段中細胞的分化。有些microRNA在造血干細胞(HSCs)和造血祖細胞(HPCs)內(nèi)表達，并發(fā)揮調(diào)控造血細胞分化功能，如miR-22、miR-29、miR-125和miR-126，在有些急性骨髓性白血病患者中，這些microRNA出現(xiàn)失調(diào)〔22〕。目前很多研究認(rèn)為miR-125家族(包括miR-125a、miR-125b1、miR-125b2)能增強干細胞的自我更新能力。miR-125家族在造血祖細胞中有較高的表達，以減少細胞的分化。然而miR-125家族的靶基因目前還不十分清楚，有可能是促凋亡的基因及與p53信號通路相關(guān)的基因。與紅細胞生成有關(guān)的microRNA有miR-15a、miR-24、miR-144、miR-451等。其中miR-24、miR-27a、miR-451能調(diào)控紅系轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和GATA-2的表達，這兩種轉(zhuǎn)錄因子能促進造血干細胞向髓系分化〔23〕。在臍血CD34+造血祖細胞向紅系發(fā)育過程中,miR-221和miR-222表達逐漸下降，這能促進紅系發(fā)育。當(dāng)過表達這兩個microRNA后，能造成紅系增殖和分化障礙。另有研究表明miR-223與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控粒細胞的分化，過度表達miR-223能促進粒細胞的分化過程〔24〕。

骨形成過程也受microRNA的調(diào)控。在骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的成骨分化過程中miR-125b是明顯降低的〔25〕。Smad4 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β骨形成信號通路中的關(guān)鍵因子，miR-125b 通過抑制靶基因Smad4 的表達，抑制BMSCs向成骨細胞分化。通過向BMSCs細胞中轉(zhuǎn)染miR-125b，雙熒光素報告檢測顯示miR-125b能特異性地與Smad4 mRNA 的3′UTR 結(jié)合，抑制Smad4表達〔26〕。相反，向BMSCs細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-125b抑制物，可以促進BMSCs細胞的成骨分化，這間接證實了miR-125b對BMSCs細胞成骨能力的抑制作用〔25〕。另外miR-30家族通過對靶基因Smad1和Runx2的抑制，對成骨細胞的分化進行負調(diào)控。過表達Smad1和Runx2可以顯著消除miR-30對成骨分化的抑制作用〔27〕。此外，microRNA還在脂肪基質(zhì)細胞分化、神經(jīng)干細胞分化、皮膚干細胞分化等諸多方面發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

5 展望

干細胞具有自我更新能力及增殖分化的能力，干細胞的這些特性為細胞移植治療衰老、損傷的組織帶來了希望，干細胞的相關(guān)研究工作一直在如火如荼的進行著。干細胞應(yīng)用于臨床之前，首先需要解決干細胞定向分化這一難題。干細胞在生物體內(nèi)所處的微環(huán)境十分復(fù)雜，許多因素影響著干細胞的增殖分化。microRNA對干細胞增殖分化的調(diào)控作用已經(jīng)被很多研究所證實，其中一些方面的研究已經(jīng)取得了可喜的成果。但是由于microRNA數(shù)量眾多，并且一個microRNA可能對數(shù)百個靶mRNA起調(diào)控作用，而一個靶mRNA可以被多個microRNA所調(diào)控，此外，microRNA還可能與其他信號通路中的相關(guān)因子發(fā)生聯(lián)系，因此microRNA對干細胞的調(diào)控機制異常復(fù)雜，仍然存在著很多未知領(lǐng)域需要去研究。但是，我們相信隨著對microRNA研究的不斷深入，最終將會揭示其調(diào)控干細胞的具體作用機制。