硫酸寡糖鋅促進(jìn)小鼠生長發(fā)育及抗氧化作用

常滿倩 安鳳平 宋洪波 黃 群 王藝偉 滕 慧

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002）

鋅是人及動(dòng)物機(jī)體的一種必需微量元素，也是兒童易缺乏的微量元素，其生物學(xué)意義直到19世紀(jì)才被注意[1-2]。缺鋅會(huì)影響蛋白質(zhì)和核酸的合成以及細(xì)胞的分化、增殖，從而引起生長發(fā)育障礙，造成食欲不振、厭食和異食癖，進(jìn)而影響兒童的生長發(fā)育[3]。據(jù)以往研究顯示，張偉淳[4]發(fā)現(xiàn)缺鋅會(huì)改變嗅覺和味覺，導(dǎo)致食欲不振，體重下降；Michael[5]調(diào)查發(fā)現(xiàn)缺鋅會(huì)引起生長遲緩；周麗玲等[6]證明缺鋅可以使大鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯加強(qiáng)，抗氧化能力下降。早期的補(bǔ)鋅劑多為ZnSO4、ZnCl2、ZnO等無機(jī)鋅，人體吸收利用率低且對消化系統(tǒng)有毒副作用。近年來，最常用葡萄糖酸鋅作為補(bǔ)鋅產(chǎn)品，而臨床顯示有惡心、便秘等不適癥狀。鋅在體內(nèi)發(fā)生作用是它的有機(jī)物或螯合物形式，而非游離的無機(jī)鋅離子，無機(jī)鋅在體內(nèi)需轉(zhuǎn)化為有機(jī)物形式而發(fā)揮作用[7]。有機(jī)鋅生物學(xué)利用率高于無機(jī)鋅，更接近于體內(nèi)的作用形式，具有生物學(xué)效價(jià)高，安全及副作用小等特點(diǎn)[8]。目前關(guān)于硫酸寡糖鋅的研究鮮有報(bào)道。

硫酸寡糖溶解性好，具有結(jié)構(gòu)簡化，易于吸收等優(yōu)點(diǎn)，硫酸寡糖分子中含有大量游離的硫酸基和羥基，對金屬離子有穩(wěn)定的配位作用。本研究以麒麟菜為原料提取硫酸多糖，并制備硫酸寡糖鋅配合物，比較硫酸寡糖鋅、硫酸鋅、葡萄糖酸鋅促進(jìn)缺鋅小鼠生長發(fā)育和抗氧化作用，為開發(fā)新型補(bǔ)鋅劑及功能食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：麒麟菜，福建漳州。

動(dòng)物：SPF級昆明雄鼠，體重 25～31g，福州總醫(yī)院。

飼料：缺鋅飼料、對照飼料，南通特洛菲飼料科技有限公司。

試劑：100～500 u、3 000 u 透析袋，北京索萊寶公司；AKP（堿性磷酸酶）試劑盒、MDA（丙二醛）測試盒、T-AOC（總抗氧化能力）試劑盒，南京建成生物工程研究所；乙醇、硫酸、NaOH、KOH、ZnSO4·7H2O均為分析純級，中國醫(yī)藥集團(tuán)；葡萄糖酸鋅（分析純級），阿拉丁試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA224S型）、數(shù)顯pH計(jì)（PB-10型），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9203A型），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100型）、冷凍干燥機(jī)（FDU-1200型），上海愛朗儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4），國華電器有限公司；加熱磁力攪拌器（RH D S25型），德國IKA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 硫酸寡糖鋅的制備 參考候麗麗[9]提取多糖的方法從麒麟菜中提取硫酸多糖，參考吳海歌等[10]水解多糖的方法進(jìn)而制備硫酸寡糖。

稱取1.00 g硫酸寡糖，加入0.88 g ZnSO4·7H2O，用 0.1 mol/L H2SO4調(diào)節(jié) pH值為6.00±0.05，60℃溫度磁力攪拌2 h；冷卻至室溫，先用100～500 u透析袋透析48 h，收集袋內(nèi)溶液，再用3 000 u透析袋透析48 h，收集袋外溶液，冷凍干燥得硫酸寡糖鋅。采用原子吸收法[11]測得硫酸寡糖鋅的含鋅量為83.8μg/mL。

1.3.2 缺鋅小鼠模式的建立 20只小鼠，隨機(jī)分為空白組和缺鋅組2個(gè)試驗(yàn)組，每組10只，飼喂于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的塑料籠中，室內(nèi)環(huán)境相對濕度60%±5%，溫度（25±1）℃。經(jīng) 3 d適應(yīng)期喂養(yǎng)后，缺鋅組飼喂缺鋅飼料，空白組飼喂對照飼料（除含鋅外，其它成分均與缺鋅飼料相同），連續(xù)飼喂16 d，自由覓食，自由飲用去離子水。

1.3.3 硫酸寡糖鋅促進(jìn)小鼠生長發(fā)育及提高抗氧化能力的喂養(yǎng)試驗(yàn) 60只小鼠，隨機(jī)分為空白組、缺鋅組、硫酸鋅組、葡萄糖酸鋅組、低寡糖鋅組、中寡糖鋅組和高寡糖鋅組等7個(gè)試驗(yàn)組，每組10只。經(jīng)3 d適應(yīng)期喂養(yǎng)后，除空白組飼喂對照飼料外，其它試驗(yàn)組均飼喂缺鋅飼料，喂養(yǎng)環(huán)境同1.3.2節(jié)所述，連續(xù)飼喂16 d。其中，硫酸鋅組、葡萄糖酸鋅組分別灌喂硫酸鋅、葡萄糖酸鋅，劑量均為6.96mg Zn/kg bw，低、中、高劑量寡糖鋅組灌喂劑量依次為1.74，3.48，6.96mg Zn/kg bw；空白組和缺鋅組小鼠以等體積生理鹽水替代，自由覓食，自由飲用去離子水。

圖1 小鼠攝食量變化Fig.1 Food intake changes of mice

1.3.4 檢測指標(biāo)及方法 生長發(fā)育：每3 d記錄攝食量，測體重1次；第17天宰殺全部小鼠，取其血清（來源于心臟取血）、肝臟、腎臟、腦和睪丸，稱量各臟器的質(zhì)量，用原子吸收分光光度計(jì)測定血清和肝臟中鋅的含量；將肝臟與生理鹽水按質(zhì)量比1∶9制成肝勻漿，離心取上清液，采用試劑盒測定血清及肝勻漿中堿性磷酸酶（AKP）活力。

抗氧化能力：分別采用專門試劑盒測定小鼠血清及肝勻漿中的丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶活力（SOD）以及總抗氧化能力（T-AOC）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠缺鋅模式的建立

小鼠的攝食量如圖1所示，與空白組小鼠相比，缺鋅組小鼠的攝食量自第4天起明顯減少（P＜0.01）；小鼠體重如圖2所示，2組小鼠體重均隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長而增大，然而缺鋅組小鼠的體重從第10天開始較大程度低于空白組小鼠（P＜0.05），至16 d體重明顯低于空白組小鼠（P＜0.01）。經(jīng)觀察，喂養(yǎng)14 d后，空白組小鼠毛色、精神狀態(tài)良好；缺鋅組小鼠毛發(fā)微黃且粗糙，且出現(xiàn)互相撕咬、情緒異?？簥^等現(xiàn)象，表明缺鋅使小鼠食欲降低，出現(xiàn)異食癖癥狀。

圖2 小鼠體重變化Fig.2 Weight changes of mice

第17天處死小鼠，測得的血清和肝臟中的鋅含量及AKP活力參見表1、表2。經(jīng)過16 d飼喂缺鋅飼料，缺鋅組小鼠的血清中的鋅含量僅為空白組的53%，肝臟中的鋅含量為空白組的69.47%，AKP活力明顯下降，缺鋅組小鼠和空白組小鼠之間存在極顯著差異（P＜0.01）。由此可見，缺鋅模式建立成功。

2.2 提升體內(nèi)鋅含量

血清可以提供細(xì)胞生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，血清中的鋅濃度是反應(yīng)機(jī)體鋅狀態(tài)的標(biāo)志性指標(biāo)[12]。肝臟是人體重要的代謝器官，是多種微量元素吸收、貯存、代謝的場所，且鋅元素與肝臟功能關(guān)系密切，故血清及肝臟中的鋅含量可反映機(jī)體對鋅吸收的水平。AKP是一種鋅依賴酶，其活性變化能夠間接反應(yīng)鋅的營養(yǎng)狀況[13]。

表1 補(bǔ)鋅對小鼠血清、肝臟中鋅含量的影響Table1 Zinc content of serum and liver after zinc supplementation

表2 補(bǔ)鋅對小鼠血清、肝臟中AKP活力的影響Table2 Activity of AKpIn serum and liver after zinc supplementation

由表1可以看出，與缺鋅組相比，各補(bǔ)鋅組小鼠血清及肝臟中鋅含量均顯著增大，其中硫酸鋅組的血清和肝臟中鋅含量在所有補(bǔ)鋅組中最低，葡萄糖酸鋅組的血清中鋅含量和肝臟中鋅含量分別為0.979μg/mL和23.71μg/g，均顯著高于硫酸鋅組，高劑量寡糖鋅組小鼠血清中鋅含量和肝臟中鋅含量最高（分別為1.136 μg/mL，26.63 μg/g），基本達(dá)到空白組（正常小鼠）的水平。對于同一組補(bǔ)鋅劑而言，血清中鋅含量低于肝臟中的鋅含量，與金月[8]研究殼寡糖對血清、骯臟中鋅含量結(jié)果一致，可能與鋅通過肝臟再進(jìn)入心臟血液中被逐步利用有關(guān)。

表2所示血清及肝臟中AKP活力，呈現(xiàn)與表1中鋅含量相似的變化趨勢，其中高劑量寡糖鋅組小鼠的AKP活力最高，基本達(dá)到與空白組的水平。血清及肝臟中AKP活力與鋅含量的響應(yīng)關(guān)系進(jìn)一步表明，喂食各補(bǔ)鋅劑時(shí)所測定的小鼠血清、肝臟中鋅含量是可靠的。

2.3 促進(jìn)攝食及生長發(fā)育

由表3可知，各組小鼠的初始攝食量和初始體重差異均不顯著，說明小鼠健康，攝食與體重均處于同一水平。

喂養(yǎng)16 d，各補(bǔ)鋅組小鼠的最終攝食量都顯著大于缺鋅組小鼠。在各補(bǔ)鋅組中，硫酸鋅組小鼠的最終攝食量最少（3.80 g），高寡糖鋅組攝食量最高（4.53 g），葡萄糖酸鋅組和中劑量寡糖鋅組小鼠的最終攝食量相當(dāng)，均顯著低于高劑量寡糖鋅組（P＜0.05）。

另外，與缺鋅組相比，各補(bǔ)鋅組小鼠的體重均顯著增加，與最終攝食量對比分析，并不存在簡單的正相關(guān)關(guān)系。雖然低劑量寡糖鋅和硫酸鋅增加小鼠攝食量的效果相當(dāng)，但低劑量寡糖鋅增加小鼠體重效果更顯著，且低劑量寡糖鋅（劑量為1.74mg Zn/kg bw）能達(dá)到與葡萄糖酸鋅（劑量為6.96mg Zn/kg bw）相當(dāng)?shù)脑黾芋w重效果；高劑量寡糖鋅（劑量為6.96mg Zn/kg bw）則較葡萄糖酸鋅顯著增加小鼠的體重，且與空白組小鼠的體重相當(dāng)。

表3 補(bǔ)鋅對小鼠攝食量和體重的影響Table3 Effects of zinc supplement on food intake and weight for mice

由表4可知，各補(bǔ)鋅劑均可在不同程度上增加缺鋅小鼠肝臟、腎臟和腦的質(zhì)量，其中硫酸鋅組僅能顯著增加缺鋅小鼠腎臟質(zhì)量，葡萄糖酸鋅組和各劑量寡糖鋅組均可顯著增加肝臟、腎臟和腦的質(zhì)量，高劑量寡糖鋅增加程度最大（分別為2.337，0.723，0.467 g），且達(dá)到與空白組相當(dāng)?shù)乃?。另外，只有各劑量寡糖鋅組顯著增加了缺鋅小鼠的睪丸重，其中，中、高劑量寡糖鋅組的睪丸質(zhì)量最大，且高劑量寡糖鋅組達(dá)到與空白組相當(dāng)?shù)乃健Ｒ虼丝傻贸?，硫酸寡糖鋅促進(jìn)小鼠生發(fā)育的效果好于葡萄糖酸鋅和硫酸鋅，高劑量硫酸寡糖鋅可全面促進(jìn)小鼠肝臟、腎臟、腦和睪丸等器官全面生長發(fā)育。

表4 補(bǔ)鋅對小鼠主要臟器質(zhì)量的影響Table4 Effects of zinc supplement on organ mass for mice

2.4 抗氧化作用

MDA反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度；SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[14]；T-AOC為總抗氧化能力，可以反映機(jī)體防御體系抗氧化能力的強(qiáng)弱。

由表5可知，各鋅補(bǔ)充劑均可顯著降低缺鋅小鼠肝臟中MDA含量，增加SOD活力和T-AOC能力，其中葡萄糖酸鋅的效果顯著優(yōu)于硫酸鋅，高劑量硫酸寡糖鋅的效果最好、其抗氧化能力超過了空白組。表6所示各鋅補(bǔ)充劑對缺鋅小鼠肝臟中MDA含量、SOD活力和T-AOC的影響，其中硫酸鋅效果不明顯，葡萄糖酸鋅的效果明顯，高劑量硫酸寡糖鋅的效果最好，其抗氧化能力亦超過了空白組。

表5 補(bǔ)鋅對小鼠肝臟中MAD、SOD和T-AOC的影響Table5 Effects of zinc supplement on MDA，SOD and T-AOC in liver

表6 補(bǔ)鋅對小鼠血清中MAD、SOD和T-AOC的影響Table6 Effects of zinc supplement on MDA，SOD and T-AOC in serum

3 討論

本研究結(jié)果表明，硫酸寡糖鋅可顯著提高血清和肝臟中的鋅含量，并且較同劑量的硫酸鋅和葡萄糖酸鋅效果好，一方面，因?yàn)橛袡C(jī)態(tài)鋅能防止鋅在體內(nèi)與植酸、草酸等結(jié)合形成難以吸收的化合物[15]，另一方面，由于不同鋅源的配體分子質(zhì)量不同，被機(jī)體吸收代謝途徑不同所導(dǎo)致[16]。此外，寡糖能夠提高消化器官的功能，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[17]，因此機(jī)體對硫酸寡糖鋅的吸收高于葡萄糖酸鋅和硫酸鋅。鋅是AKP合成所必需的金屬元素，且在一定范圍內(nèi)與鋅含量成正比[18]，本研究結(jié)果表明，硫酸寡糖鋅較硫酸鋅和葡萄糖酸鋅更能提高AKP活力，這與機(jī)體對硫酸寡糖鋅的吸收高于葡萄糖酸鋅和硫酸鋅相一致。

鋅也是唾液蛋白的重要成分，對口腔及味蕾的功能和代謝具有重要作用，可改善食欲，增加攝食量[19]，硫酸寡糖鋅能夠更顯著增加缺鋅小鼠攝食量、體重，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道殼寡糖鋅的效果相似；硫酸寡糖鋅能更明顯地增加缺鋅小鼠的肝臟、腎臟、腦及睪丸的質(zhì)量，是因?yàn)殇\可影響機(jī)體生長激素和生長調(diào)節(jié)素等的合成與分泌，提高機(jī)體的解毒能力、智力和性行為[8，20-21]，促進(jìn)相關(guān)器官發(fā)育，從而進(jìn)一步改善食欲，增加體重。有研究證實(shí)，寡糖既能提高小鼠肝臟質(zhì)量[22]，也能提高機(jī)體的免疫功能，進(jìn)而促進(jìn)生長[23]。因此，硫酸寡糖的增效作用使得硫酸寡糖鋅較硫酸鋅和葡萄糖酸鋅可以更好地促進(jìn)生長發(fā)育。

機(jī)體通過非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基會(huì)攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如醛基（MDA）、酮基、羥基、羰基、氫過氧基或內(nèi)過氧基，以及新的氧自由基等，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。MDA的量直接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細(xì)胞損傷程度；SOD對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受傷害；T-AOC水平直接反映機(jī)體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物的總體水平[14]。鋅是機(jī)體抗氧化體系的重要組成之一，它能防止細(xì)胞膜氧化，減少超氧陰離子形成[24]。鋅缺乏時(shí)，脂肪氧化增加，可能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[25-27]。各補(bǔ)鋅劑均可降低小鼠的MDA含量，提高SOD及T-AOC活力，這與荔霞等[28]、劉磊等[29]的研究報(bào)道一致；并且抗氧化能力變化與血清鋅和肝臟鋅的變化基本一致，這與鋅對機(jī)體抗氧化作用的影響相吻合。有研究表明，寡糖可降低機(jī)體內(nèi)MAD含量，顯著提高SOD、T-AOC活性[30]，具有良好的抗氧化能力。因此，高劑量硫酸寡糖鋅的抗氧化能力優(yōu)于相同劑量的硫酸鋅和葡萄糖酸鋅的抗氧化效果，乃至超過空白組（正常小鼠）的抗氧化能力。

硫酸寡糖鋅具有更好的促進(jìn)缺鋅小鼠生長發(fā)育和抗氧化能力，可能由于硫酸寡糖中含有大量的硫酸基和羥基，與鋅配位后，使配位部分與暴露的活性基團(tuán)協(xié)同作用，增強(qiáng)機(jī)體對鋅的吸收從而促進(jìn)生長發(fā)育；同時(shí)也促進(jìn)了與自由基的作用，提升了其抗氧化能力[31]。