T-SPOT.TB聯(lián)合基因芯片檢測在老年肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

孫桂英 趙剛 高勝利 黃媚 俞凈 鈕志林

(蘇州市第九人民醫(yī)院感染科，江蘇 蘇州 215200)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌誘發(fā)的一種慢性傳染性疾病，對機(jī)體諸多重要臟器均有侵襲性，臨床以肺部結(jié)核感染最為常見〔1〕。機(jī)體在感染結(jié)核菌之后并不一定發(fā)病，只有在細(xì)胞介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)增高或抵抗力減弱后，才可能發(fā)病，疾病早期若得到及時(shí)的診斷及合理的治療，大多可治愈〔2〕。至今，結(jié)核病的病原學(xué)診斷依然依賴于培養(yǎng)法與涂片法，其中涂片法的應(yīng)用敏感度與特異度均較低，而作為金標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)法，在進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)需要耗費(fèi)較長的時(shí)間，至少需要4 w才能獲得確切的結(jié)果，加之該技術(shù)操作程序繁瑣、重復(fù)性較差，臨床應(yīng)用受到限制〔3，4〕。故找到一種新型、快速且準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，快速完成結(jié)核分枝桿菌檢測與耐藥性分析，對爭取治療時(shí)間、改善預(yù)后意義重大。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因?qū)W檢測技術(shù)的發(fā)展，各類新型檢測技術(shù)的出現(xiàn)為結(jié)核病的早期快速診斷帶來希望?；蛐酒夹g(shù)是一種核酸檢測手段，能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌各主要基因及常見突變位點(diǎn)快速檢測，并很好地鑒定其他非結(jié)核分枝桿菌菌屬〔5〕。除基因芯片檢測外，T-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用對結(jié)核病診斷也有重要價(jià)值〔6〕。本研究主要觀察T-SPOT.TB與基因芯片聯(lián)合檢測用于老年肺結(jié)核診斷的臨床價(jià)值，以指導(dǎo)未來老年肺結(jié)核的早期診斷。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇蘇州市第九人民醫(yī)院300例在2016年6月至2019年6月門診或住院高度疑似肺結(jié)核的患者作為研究對象，全部患者接受痰標(biāo)本檢查、實(shí)驗(yàn)室生化指標(biāo)檢查、胸部影像學(xué)檢查、診斷性抗結(jié)核治療等臨床手段。其中男167例，女133例；年齡60～90〔平均(72.47±6.44)〕歲；體重45～75〔平均(58.12±5.11)〕kg；主要臨床表現(xiàn)包括：午后低熱、乏力、盜汗、納差、消瘦、咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等。本研究的實(shí)施征得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，全部患者及其家屬對研究的開展知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、腎等重要臟器功能損害者，合并免疫系統(tǒng)疾病者，合并血液系統(tǒng)疾病者，合并其他感染性疾病者，合并惡性腫瘤疾病者，伴有精神疾病或心理障礙等無法很好地配合研究者。

1.2研究方法 全部檢測方法所用試劑、染色液、培養(yǎng)液、顯色液、均由珠海貝索生物科技有限公司提供。緩沖液、提取液、基因芯片、相關(guān)試劑盒等均由北京博奧生物有限公司提供。T-SPOT.TB聯(lián)合基因芯片檢測陽性判定：其中1項(xiàng)為陽性則可判定陽性。

1.2.1T-SPOT.TB檢測 嚴(yán)格參照T-SPOT.TB試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序完成操作。采集全部納入者的外周血5 ml，將其置于肝素抗凝管內(nèi)，在室溫下保存，并在4 h內(nèi)完成標(biāo)本的送檢。在生物安全柜內(nèi)使用密度梯度離心法對外周血提取單個(gè)核細(xì)胞，將提取所得的單個(gè)核細(xì)胞實(shí)施洗滌與提純。使用顯微鏡行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將陽性質(zhì)控品、抗原、培養(yǎng)基等加入A板調(diào)控內(nèi)，保證各板孔中有25萬個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)板培養(yǎng)條件為：溫度：37℃，5%二氧化碳，培養(yǎng)時(shí)間為16～20 h。緩沖液洗板，每孔內(nèi)加入配置酶標(biāo)二抗工作液50 ml，孵育1 h，孵育條件為2～8℃，再次緩沖液洗板，顯色后使用蒸餾水洗板，終止顯色后使用光學(xué)顯微鏡行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果判定：若陰性對照孔計(jì)數(shù)≥6，檢測孔計(jì)數(shù)≥2倍的陰性孔計(jì)數(shù)，則判定為陽性，反之則為陰性。

1.2.2基因芯片法 利用基因芯片檢測儀器處理標(biāo)本并發(fā)現(xiàn)突變基因，操作步驟包括標(biāo)本處理、提取核酸、PCR擴(kuò)增、雜交反應(yīng)、掃描芯片、自動(dòng)判讀。

1.2.3涂片檢查 參照《痰片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》〔7〕中的相關(guān)要求操作。

1.2.4液體培養(yǎng) 使用BACTEC MGIT960培養(yǎng)基，參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》〔8〕中相關(guān)要求進(jìn)行培養(yǎng)操作，全部涂片使用的標(biāo)本需要進(jìn)行培養(yǎng)檢查。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、采用Kappa法檢驗(yàn)T-SPOT.TB檢測、基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性(Kappa≥0.75代表高度一致，Kappa值范圍為0.4≤且<0.75代表一致性較好，Kappa值<0.4代表一致性差)。

2 結(jié) 果

2.1液體培養(yǎng)與涂片檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果 300例老年高度疑似肺結(jié)核患者采集痰樣本300份，經(jīng)培養(yǎng)與涂片檢測后結(jié)果顯示，檢出結(jié)核分枝桿菌者165例，陽性率為55.00%；其他135例未檢出結(jié)核分枝桿菌，為陰性，陰性率為45.00%。

2.2T-SPOT.TB檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果 165例經(jīng)液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果呈陽性的患者經(jīng)T-SPOT.TB檢測結(jié)果顯示，陽性者139例，陰性者26例；135例經(jīng)液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果呈陰性的患者，經(jīng)T-SPOT.TB檢測結(jié)果顯示，陽性者42例，陰性者93例。整體符合率為77.33%(232/300)。將液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，T-SPOT.TB檢測用于老年肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為84.24%(139/165)、68.89%(93/135)、76.80%(139/181)、78.15%(93/119)。T-SPOT.TB檢測與金標(biāo)準(zhǔn)一致性Kappa值為0.537，一致性一般。

2.3基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果 165例經(jīng)液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果呈陽性的患者經(jīng)基因芯片檢測結(jié)果顯示，陽性者142例，陰性者23例；135例經(jīng)液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果呈陰性的患者，經(jīng)基因芯片檢測結(jié)果顯示，陽性者11例，陰性者124例。整體符合率為88.67%(266/300)。將液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測用于老年肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為86.06%(142/165)、91.85%(124/135)、92.81%(142/153)、84.35%(124/147)?；蛐酒瑱z測與金標(biāo)準(zhǔn)一致性Kappa值為0.773，一致性好。

2.4T-SPOT.TB聯(lián)合基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果 165例經(jīng)液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果呈陽性的患者經(jīng)T-SPOT.TB聯(lián)合基因芯片檢測結(jié)果顯示，陽性者160例，陰性者5例；135例經(jīng)液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果呈陰性的患者，經(jīng)T-SPOT.TB聯(lián)合基因芯片檢測結(jié)果顯示，陽性者32例，陰性者103例。整體符合率為87.67%(263/300)。將液體培養(yǎng)與涂片檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，T-SPOT.TB聯(lián)合基因芯片檢測用于老年肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為96.97%(160/165)、76.30%(103/135)、83.33%(160/192)、95.37%(103/108)。T-SPOT.TB聯(lián)合基因芯片檢測與金標(biāo)準(zhǔn)一致性Kappa值為0.751，一致性好。

3 討 論

結(jié)核病是對人類健康有嚴(yán)重危害的傳染性疾病，早期篩查與確診對疾病的治療及預(yù)后均有重要意義。痰涂片抗酸染色法是結(jié)核分枝桿菌早期檢測的相對快速的方法，但該方法早期極易受到其他因素干擾，結(jié)果的靈敏度與特異度均較低，通常與痰培養(yǎng)結(jié)果聯(lián)合判定〔9〕。痰培養(yǎng)被認(rèn)為是相對準(zhǔn)確的結(jié)核分枝桿菌檢測方法之一，其在臨床上多用作結(jié)核分枝桿菌“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該檢測方法操作繁瑣，得到結(jié)果的時(shí)間相對較長，在實(shí)際應(yīng)用中受到明顯限制〔10〕。故找到一種新型的檢測技術(shù)可以快速且準(zhǔn)確的篩查出結(jié)核病是目前臨床研究的重難點(diǎn)。

T-SPOT.TB技術(shù)主要通過測定結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原來刺激機(jī)體生成γ-干擾素水平表達(dá)來判定機(jī)體是否被結(jié)核桿菌所感染，因卡介苗缺乏這些特異性的抗原，故經(jīng)T-SPOT.TB技術(shù)檢測出來的陽性結(jié)果基本可以將因卡介苗接種引起的假陽性排除〔11，12〕。此外，T-SPOT.TB技術(shù)使用的標(biāo)本主要為體液或血液，更容易獲取，在臨床中的應(yīng)用更具推廣價(jià)值〔13〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB技術(shù)用于老年肺結(jié)核診斷的靈敏度雖理想，但特異度相對較低，且與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性一般，故還應(yīng)考慮將其與其他技術(shù)聯(lián)合使用，以提高診斷價(jià)值。基因芯片技術(shù)是近幾年逐漸被臨床關(guān)注的一種新型技術(shù)，該技術(shù)是將玻璃等固相作為載體，通過高密度的方式將生物信息分子固定，并將需要檢測的樣本DNA或RNA同探針雜交，并在雜交后通過特定的儀器與系統(tǒng)進(jìn)行掃描與顯色，量化后對雜交結(jié)果進(jìn)行分析，從而得到想要的檢測結(jié)果〔5，14〕。基因芯片技術(shù)在分子突變的檢測中，不僅能夠了解基因突變的位點(diǎn)及類型，同時(shí)還可以測定多個(gè)基因乃至整個(gè)基因組所產(chǎn)生的突變，相較于其他同類檢測技術(shù)，其具有高靈敏度的特點(diǎn)〔15，16〕。陳蕾〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，將基因芯片檢測用于結(jié)核病的早期篩查診斷有著較高的臨床價(jià)值，不僅能夠快速檢測出樣本中結(jié)核分枝桿菌感染情況，還能檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼、利福平等耐藥突變，鑒別出其他非結(jié)核分枝桿菌屬。本研究結(jié)果顯示，基因芯片與T-SPOT.TB聯(lián)合檢測診斷老年肺結(jié)核的特異度雖較基因芯片技術(shù)單獨(dú)使用有一定降低，但其整體的靈敏度、陰性預(yù)測值得到提高，說明二者聯(lián)合應(yīng)用仍較單獨(dú)應(yīng)用具有更為關(guān)鍵的價(jià)值?？蓽p少老年肺結(jié)核早期漏診，且與金標(biāo)準(zhǔn)有較好的一致性，可考慮將其作為老年肺結(jié)核早期主要篩查診斷方法。