外泌體的分離鑒定和生物學功能研究進展

霍彩云，霍 華，唐玉玲，郭曉桐，楊光輝，李穎鑫，王書揚，胡艷欣

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀 100193；2.北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097；3.呂梁市中心醫(yī)院，山西 呂梁 033000)

外泌體是指由磷脂雙分子層膜包裹蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸形成的囊泡結構，可以由幾乎所有種類的細胞分泌，并存在于各種體液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、羊水、惡性腫瘤、腹水等，是細胞間信號運輸?shù)闹饕d體[1]。近年來，由于其獨特的生物學功能，使外泌體被越來越多的科學家關注，并且常被用于腫瘤診斷的早期檢測標志物和疾病的臨床治療中。本文從外泌體的分離鑒定、生物學功能以及在疾病中的臨床應用等方面加以綜述，以期為外泌體在臨床中的診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 分離

目前對外泌體的分離主要采用4種方法，包括分級超速離心法、梯度密度離心法、超濾法和使用試劑盒提取。其中，分級超速離心法是分離高純度外泌體的經(jīng)典方法，具有操作簡單、技術難度低等優(yōu)勢。由于活細胞釋放多樣的胞外囊泡，例如外泌體、微泡或凋亡小體等，其具有不同的結構和生物學特性[2]。外泌體直徑約為50～100 nm，微囊泡尺寸直徑約為100～1 000 nm，凋亡細胞所釋放的凋亡小體直徑約為50～1 000 nm，通常可通過分級超速離心法將這些尺寸不等的囊泡分離出。當離心力為2 000 g時可分離出大的囊泡，而離心力為100 000 g 時即分離出尺寸小于150 nm的囊泡，可稱為外泌體。然而，有文獻證實這些尺寸小于150 nm的囊泡不僅是外泌體，還包括其他的囊泡[3]。梯度密度離心法、超濾法也經(jīng)常用于外泌體的提取，但是其純度較超速離心法低。然而，這3種方法均對樣本的需求量大且提取過程中外泌體的損失量較多，對于如血清等稀少樣品而言，存在一定的缺陷。隨著技術的進步，外泌體抽提試劑盒被用于樣品的外泌體分離中，尤其適用于稀少樣本或外泌體分泌量少的樣本。該試劑盒通?；诰酆衔锍恋矸?，原理是體積排阻的聚合物通過奪取水分子使外泌體溶解度降低，進而在低速離心條件下發(fā)生沉降。盡管該方法具有快速、靈敏、節(jié)約樣本和產(chǎn)量高等優(yōu)點，但因其得到的外泌體純度低而影響了外泌體功能等研究結果的可信度。因此，這4種方法各有利弊，在實際中應根據(jù)試驗要求選用合適的提取方法，以期分離到高純度的外泌體。

2 鑒定

外泌體鑒定可分為3個層面：形態(tài)學特征、蛋白標志物、粒徑和濃度。首先，外泌體的鑒定可通過電鏡法來進行形態(tài)學觀察。在普通透射電鏡下，外泌體多位于細胞外周并呈典型的扁平球狀圓形膜性囊泡結構，其粒子大小和部分形態(tài)結構與流感病毒極其相似[4-5]。近年來，冷凍電鏡技術也常被用于囊泡的形態(tài)學研究中，該方法是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設備，應用冷凍固定術將樣品冷卻到液氮溫度，用于觀察蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品，可以降低電子束對樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實的樣品形貌。該方法不僅可觀察囊泡的外部結構、細胞膜和內(nèi)腔，還可清晰地觀察脂質(zhì)雙分子層和囊泡內(nèi)部結構。已有研究通過該方法證實了單一類型細胞分泌的外泌體具有形態(tài)多樣性，發(fā)現(xiàn)人源肥大細胞釋放的外泌體在冷凍電鏡下呈現(xiàn)多種不同的形態(tài)特征，根據(jù)其形態(tài)差異可將其分為9個亞群，例如含脂質(zhì)雙分子層的圓形的單一囊泡、大囊泡內(nèi)和小囊泡共存的圓形或略長方形的雙囊泡和含脂質(zhì)雙分子層的細長的管狀囊泡等，而這些不同亞群具有不同的功能和理化性質(zhì)[6]。

此外，外泌體的進一步鑒定可通過Western Blot技術加以輔助。外泌體包含的蛋白質(zhì)成分具有多樣性，很大程度上取決于其來源的細胞種類。由于維持外泌體生物發(fā)生、結構及功能的蛋白質(zhì)組成具有保守性，包括生物大分子運輸所需的內(nèi)含體分選轉(zhuǎn)運復合體的組成蛋白Alix和TSG101、四跨膜蛋白超家族的CD63、CD9和CD81等，這些蛋白在外泌體中具有較高的豐度，常被用作研究外泌體的特異性標志物[7-8]。

近年來，納米顆粒追蹤分析(NTA)技術也被用于外泌體的表征鑒定。該技術旨在對10～2 000 nm范圍內(nèi)的納米顆粒進行快速實時動態(tài)檢測，測量參數(shù)包括顆粒粒徑、散射光強、濃度等。納米顆粒跟蹤分析儀的光束用于照射外泌體樣品中的顆粒，其攝像頭能夠捕捉布朗運動下移動顆粒的視頻文件，并通過分析技術軟件單獨追蹤多個顆粒并利用愛因斯坦方程式計算顆粒濃度和粒度分布。相比于其他表征方式，NTA技術不破壞外泌體原始狀態(tài)，并且可搭配相應濾光片用于測量熒光抗體(如CD9,CD63,CD81等)標記的外泌體來確定外泌體純度，而且具有檢測速度快的特點。有研究利用該技術成功的發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡在機體內(nèi)的分布依賴于細胞類型、人為注射囊泡的方式和劑量以及靶器官等因素[9]。

3 生物學功能

外泌體承擔著細胞間通訊分子的角色，攜帶著多種蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等信息物質(zhì)，廣泛參與了細胞間物質(zhì)和信息的傳遞，在細胞間交流、免疫應答及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生理和病理過程中起重要的作用。外泌體經(jīng)胞吐方式分泌后，其攜帶物質(zhì)可影響局部微環(huán)境或通過體液循環(huán)在遠離母細胞的部位發(fā)揮作用[10]。外泌體作用于靶細胞參與細胞間信息傳遞主要有3種方式：一是外泌體上特殊的表面蛋白可與靶細胞的受體結合，而不需要被靶細胞攝取，進行跨膜信號的傳導(如抗原呈遞的過程)；二是與細胞膜融合，攜帶的蛋白質(zhì)和核酸被轉(zhuǎn)運至靶細胞內(nèi)；三是以胞吞形式被攝取。當進入靶細胞后，外泌體所攜帶的信息物質(zhì)發(fā)揮其重要功能，外泌體中的mRNA進入到靶細胞后，能利用靶細胞的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)，翻譯成相應蛋白，從而調(diào)控靶細胞的功能。研究表明，結腸直腸癌細胞分泌的外泌體含細胞周期相關的mRNA，可促進內(nèi)皮細胞的增殖，進而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并在局部和遠處的轉(zhuǎn)移位點形成有利于轉(zhuǎn)移和侵襲的細胞微環(huán)境[11-12]。除此之外，利用二代測序等技術發(fā)現(xiàn)，外泌體中還包含了小分子RNA(microRNA)、長鏈非編碼RNA (IncRNA)、線粒體DNA (mtDNA)、雙鏈DNA (dsDNA)、基因組DNA (gDNA) 和環(huán)狀RNA (cirRNA)等特殊核酸，對靶細胞的基因表達和生物學功能起到調(diào)控作用[13-15]。例如，肝細胞癌來源的外泌體miR-21促進成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞(CAF)的轉(zhuǎn)化，活化的CAF通過分泌血管生成細胞因子進一步促進腫瘤進展[16]。腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中促進腫瘤進展的主要參與者和協(xié)調(diào)者，可極化為M1型或M2型巨噬細胞，研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞衍生的外泌體高表達的miR-21-5p 和miR-155-5可介導結直腸癌細胞的遷移和侵襲[17]。最新研究表明，巨噬細胞衍生的外泌體可將miR-223這種microRNA遞送至卵巢癌細胞，通過miR-223/PTEN-PI3K/AKT信號傳導途徑引起腫瘤細胞化療耐藥性[18]。cirRNA被認為是腫瘤發(fā)展的關鍵因子，有研究發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞可通過分泌含有circCPTGR1的外泌體來促進較低轉(zhuǎn)移或無轉(zhuǎn)移潛能細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力[19]。

不同類型細胞分泌的外泌體中蛋白質(zhì)的種類也存在差異，例如人類樹突狀細胞(Dendritic cells,DC細胞)產(chǎn)生的外泌體含有主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex,MHC)I類和II類分子，這類分子與外源性抗原的肽段結合，使T淋巴細胞有效活化，從而誘導T淋巴細胞的免疫應答，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[20]。最新研究發(fā)現(xiàn)，外泌體介導的干擾素誘導跨膜蛋白IFITM2向樹突狀細胞的傳遞抑制了IFNα途徑的活化并阻斷外源IFNα的抗慢性乙型肝炎功效[21]。

在一些病毒感染過程中，外泌體可以攜帶病毒的核酸、蛋白質(zhì)甚至整個病毒粒子，產(chǎn)生影響靶細胞生長，增強靶細胞的易感性，創(chuàng)造有利于病毒感染的微環(huán)境等效應。有的病毒可以讓外泌體攜帶病毒需要的細胞表面受體，增加易感細胞的類型，擴大病毒的感染范圍。如肝癌感染的細胞具有針對性，需要宿主細胞上存在特異的受體(CD4分子和輔助受體CXCR4或CCR5)，外泌體可以攜帶來自宿主細胞的CXCR4或CCR5，將其傳遞給受體陰性的細胞，使其產(chǎn)生易感性，最終促進小鼠肝癌細胞的遷移、侵襲和淋巴管的生成[22]。在丙肝病毒(Hepatitis C virus,HCV)的研究中發(fā)現(xiàn)，HCV可以留存在晚期胞內(nèi)體的腔內(nèi)囊泡中，并通過外泌體直接將整個病毒粒子或病毒的RNA和蛋白遞送至臨近的細胞來擴大感染[23-24]。

4 外泌體在疾病中的應用

作為細胞間物質(zhì)或信息交流的重要載體，外泌體因其獨特的生物學結構和功能被廣泛的應用于疾病的診斷和治療中。外泌體攜帶有生物信息物質(zhì)，可以作為一種生物標志物，用于心血管疾病、腎臟疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥的早期篩查以及診斷中。其中，外泌體在實體腫瘤領域研究比較廣泛。相比正常細胞，腫瘤細胞可分泌更多的外泌體，并且缺氧微環(huán)境促進腫瘤細胞的外泌體釋放和誘導促血管生成微囊泡的脫落增加[25]。在癌癥的早期檢測中，腫瘤衍生的外泌體攜帶有腫瘤特定的蛋白質(zhì)，有助于腫瘤的篩選和診斷。在某些癌癥(如結腸直腸癌、胰腺癌和卵巢癌)中，外泌體中腫瘤相關性蛋白性生物標志物的類型和表達水平與癌癥類別的存在和進展密切相關，研究證明腸道間質(zhì)瘤分泌的外泌體富含豐富的診斷標志，如CD34和ENG等[26-27]。由于外泌體具有體積小、含脂質(zhì)雙分子層結構、良好的生物相容性、可通過血腦屏障等優(yōu)點，使其成為先進藥物遞送和治療的新一代內(nèi)源性納米材料[28]。例如在腫瘤治療中，針對特定癌癥類型的癌細胞的表面受體，設計高親和的配體來修飾裝載了藥物的外泌體，能達到靶向遞藥的效果[29]。在組織損傷和修復過程中，外泌體也發(fā)揮關鍵性作用。干細胞及其分泌的外泌體在促進骨再生方面具有相似的作用，有研究者發(fā)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可通過缺氧誘導因子(HIF)-1α介導的血管生成促進大鼠骨折愈合[30]。

5 展望

外泌體不僅是細胞分泌的內(nèi)容物，同時也代表了一種復雜的胞內(nèi)處理特異性分子的方式，已逐漸成為疾病相關研究的熱點。由于獨特的生物學特性和在體內(nèi)的廣泛分布，使外泌體成為用于疾病診斷和治療的有力“武器”，在相關臨床診斷中具備廣闊的應用前景。然而，外泌體的分子機制、檢測和治療方法還需進一步研究。例如，臨床中用以準確快速區(qū)分外泌體和其他囊泡的平臺仍未健全，在未來研究中仍需探索新型高度靈敏地鑒定不同種類囊泡的方法。此外，研究能夠提取大量外泌體的新策略、提高外泌體靶向給藥的效率等依然是外泌體用于癌癥診斷和治療領域亟待解決的問題。隨著外泌體的不斷深入研究，我們相信其在疾病診斷和治療中將有著廣闊的發(fā)展前景。