犬間充質(zhì)干細(xì)胞在獸醫(yī)臨床的應(yīng)用

胡瑭琦 ， 李秋艷 ， 鐘友剛

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 海淀 100193)

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我更新能力且能分化為其他細(xì)胞類型的細(xì)胞，因其具有較大的治療潛力，近年來(lái)在寵物疾病診療方面逐漸成為研究熱點(diǎn)。本文概括了利用犬間充質(zhì)干細(xì)胞治療犬的幾種疾病及其研究進(jìn)展，包括骨關(guān)節(jié)炎、心臟病、糖尿病、神經(jīng)損傷等治愈率較低的疾??；同時(shí)對(duì)干細(xì)胞治療的現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，為今后開(kāi)展犬及其他寵物疾病干細(xì)胞治療的研究、應(yīng)用提供參考依據(jù)，促進(jìn)寵物診療行業(yè)的發(fā)展。

1 簡(jiǎn)介

干細(xì)胞(Stem Cell)是一類可以進(jìn)行自我復(fù)制的多能細(xì)胞[1]。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell，ESC)和成體干細(xì)胞(Somatic Stem Cell，SSC)。成體干細(xì)胞可以從許多分化的組織中獲得，包括骨髓、脂肪和肌肉等[2]。成體干細(xì)胞又包括間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs) 和造血干細(xì)胞。

大多數(shù)研究所討論的成體干細(xì)胞實(shí)際上是間充質(zhì)干細(xì)胞。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，多個(gè)研究小組先后證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成肌細(xì)胞等各胚層細(xì)胞,是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞。目前，大多數(shù)犬、貓臨床試驗(yàn)使用的間充質(zhì)干細(xì)胞主要為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)和臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(UCBMSCs)。

干細(xì)胞療法在近代科學(xué)研究中是一個(gè)創(chuàng)新領(lǐng)域，通過(guò)用干細(xì)胞產(chǎn)生的健康細(xì)胞替代組織內(nèi)的受損細(xì)胞以達(dá)到治療疾病的目的[2]。干細(xì)胞療法中，成體干細(xì)胞是目前研究最多、成功率最高的細(xì)胞來(lái)源，其再生特性以及它們可改變受傷和患病組織周圍環(huán)境的能力使得許多疾病的治療成為可能。特別是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，它們易于獲得、分離和培養(yǎng)擴(kuò)增；可以遷移到受損區(qū)域、支持其他細(xì)胞生長(zhǎng)以及減弱機(jī)體免疫反應(yīng)。有研究證實(shí)，MSCs在靜脈注射后具有向全身特別是向缺氧或損傷組織區(qū)域遷移的能力[3]；注射后也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用以及腫瘤的形成[4]。近幾年，間充質(zhì)干細(xì)胞療法在人類醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用效果顯著，其應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)在心血管、神經(jīng)學(xué)和免疫疾病的臨床試驗(yàn)中得到了廣泛證實(shí)。

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注自身寵物的健康，對(duì)于寵物疾病治療的訴求日漸增加，其中犬是飼養(yǎng)數(shù)量最多也是寵物臨床行業(yè)最關(guān)注的種類。由于人與犬的基因序列同源性大于人與嚙齒動(dòng)物的基因序列同源性，二者在生理特點(diǎn)和疾病(尤其是遺傳病)上都具有相似性，因此在發(fā)展人類干細(xì)胞療法的過(guò)程中，犬常被用作主要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這也為干細(xì)胞療法在治療犬類疾病上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[5]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞治療犬類疾病的應(yīng)用

2.1 骨關(guān)節(jié)炎 骨關(guān)節(jié)炎(OA)是由于分解代謝和合成代謝失衡導(dǎo)致犬、貓出現(xiàn)慢性疼痛的常見(jiàn)原因，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的退化、侵蝕。常規(guī)治療方法如注射甾體和非甾體抗炎藥(NSAIDs)可以緩解疼痛，但不能促進(jìn)其恢復(fù)。另外，NSAIDs具有腎毒性，應(yīng)避免長(zhǎng)期用藥。獸醫(yī)臨床上OA的干細(xì)胞治療試驗(yàn)主要是針對(duì)犬的髖關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)，并且主要采用的是ADMSCs進(jìn)行治療性試驗(yàn)。Vilar 等[6]采用髖關(guān)節(jié)內(nèi)單次注射ADMSCs，同時(shí)與富含生長(zhǎng)因子(PrP)的關(guān)節(jié)內(nèi)自體血小板或透明質(zhì)酸(HA)一起用作軟骨保護(hù)劑，分別比較了ADSCs-PrP、ADSCs-HA和ADSCs-SVF(新鮮基質(zhì)血管組分)的治療效果，結(jié)果表明，這3組對(duì)于患犬后肢功能恢復(fù)都有顯著改善。Black等[7]的一項(xiàng)雙盲試驗(yàn)同樣表明，ADMSCs可以改善髖關(guān)節(jié)炎患犬的跛足、疼痛和運(yùn)動(dòng)范圍評(píng)分。

隨后，該實(shí)驗(yàn)室[8]與Guercio等[9]先后證實(shí)ADMSCs還能治療犬肘關(guān)節(jié)炎。除此之外，還有學(xué)者將自體ADMSCs用于治療犬膝關(guān)節(jié)炎，結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)骨贅和軟骨下囊性病變均有減輕[10]。

2.2 骨缺損 在人類和寵物，特別是犬上，干細(xì)胞療法對(duì)于改善骨折、節(jié)段性缺損、骨愈合，改良用于全關(guān)節(jié)置換的植入物以及關(guān)節(jié)融合術(shù)都有著重要的臨床意義。美國(guó)塔夫斯大學(xué)治療學(xué)實(shí)驗(yàn)室先后研究了自體和同種異體BMSCs對(duì)于骨缺損的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用合適的生物支架結(jié)合BMSCs的治療方法，都可以增強(qiáng)長(zhǎng)骨缺損中的骨再生能力，且不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)[11-12]。

除了長(zhǎng)骨骨缺損外，MSCs在犬下頜骨重建以及繼發(fā)于牙周病的骨吸收修復(fù)方面都具有臨床應(yīng)用潛力[13-15]。因此基于MSCs的治療可以在各種臨床相關(guān)條件下改善骨形成，從而應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。

2.3 神經(jīng)肌肉損傷 脊髓損傷是導(dǎo)致犬運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能障礙的重要臨床疾病，通常繼發(fā)于椎間盤(pán)疾病(IVDD)以及其他退行性或創(chuàng)傷性原因，不僅對(duì)患犬的生活質(zhì)量造成影響，也加大了主人的飼養(yǎng)負(fù)擔(dān)。一些研究表明，MSCs移植可以改善犬脊髓損傷試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭泄δ苄陨窠?jīng)的恢復(fù)，Ryu等人[16]評(píng)估了同種異體ADMSCs在急性脊髓損傷犬中的植入效果，磁共振成像和神經(jīng)細(xì)胞組織病理學(xué)表明：治療組相較于對(duì)照組在神經(jīng)傳導(dǎo)速度、體感誘導(dǎo)電位和神經(jīng)功能上均有所改善。相關(guān)文獻(xiàn)還對(duì)比了同種異體與自體ADMSCs對(duì)脊髓損傷后的功能恢復(fù)，結(jié)果顯示，自體ADMSCs效果更好，但二者的作用效果都明顯好于對(duì)照組[17]。Lim等[18]證明了臍帶血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(UCBMSCs)對(duì)于犬脊髓損傷也有改善作用。除了單獨(dú)使用MSCs進(jìn)行治療之外，有學(xué)者將ADMSCs預(yù)先分化為神經(jīng)誘導(dǎo)性間充質(zhì)干細(xì)胞(NMSC)，將基底膜與NMSC聯(lián)合應(yīng)用于脊髓損傷的犬上，結(jié)果顯示出二者共同作用對(duì)神經(jīng)功能具有更好的修復(fù)效果，除了減輕損傷處炎癥反應(yīng)外，還可以增加與神經(jīng)元的延伸、其標(biāo)志物以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)[19]。

MSCs除了有治療脊髓損傷的可能之外，還可以有效治療其他神經(jīng)肌肉病變。如BMSCs可以促進(jìn)犬坐骨神經(jīng)損傷周圍的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[20]；肌原分化的MSCs可治療犬杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等等[21]。

2.4 心臟疾病 大約10%的寵物犬患有心臟病，包括心肌梗死和擴(kuò)張型心肌病[22]，這強(qiáng)調(diào)了開(kāi)發(fā)干細(xì)胞替代療法來(lái)治療心臟病患犬的必要性。雖然MSCs分化為心肌細(xì)胞的能力存在爭(zhēng)議，但MSCs已被證明能顯著改善犬的心臟功能及其存活率[23-24]。

Memon等[25]將自體BMSCs直接注射到犬心臟的受損部位，4周后彩超結(jié)果顯示：治療組犬的心臟功能與對(duì)照組相比有明顯改善，這表明自體MSCs的輸入性治療手段能夠促進(jìn)心肌生成和血管再生，增強(qiáng)心臟功能。不僅如此，另有學(xué)者將BMSCs與手術(shù)相結(jié)合治療犬心律失常，證明MSCs可以促進(jìn)心房和心室肌的融合，改善傳導(dǎo)缺陷[26]。這些研究都為犬心臟疾病的臨床治療提供了新的可行性方案。

2.5 炎性腸病 炎性腸病(IBD)是導(dǎo)致犬慢性胃腸疾病的常見(jiàn)原因，治療方案大多是使用皮質(zhì)類固醇藥物抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，然而隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，這些藥物不僅會(huì)使機(jī)體反應(yīng)能力降低、臨床癥狀復(fù)發(fā)，通常還會(huì)引起不良反應(yīng)[27]。Merino等[28]對(duì)12只患有IBD的犬單次靜脈注射同種異體ADMSCs，然后通過(guò)使用2種不同的臨床評(píng)分系統(tǒng)(包括實(shí)驗(yàn)室診斷和體格檢查)，持續(xù)監(jiān)測(cè)42 d后，發(fā)現(xiàn)2項(xiàng)評(píng)分的指標(biāo)都有所改善。

2.6 糖尿病 在犬上，最常見(jiàn)的糖尿病類型為1型糖尿病，這是由于胰腺中的β細(xì)胞分泌胰島素不足導(dǎo)致的絕對(duì)或相對(duì)胰島素缺乏所致，最終會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞功能喪失、低胰島素血癥、葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞受損以及肝糖原異生和糖原分解的加速[29]。臨床上患犬表現(xiàn)多飲、多尿、多食、體重減輕的癥狀。1型糖尿病犬的β細(xì)胞功能喪失是不可逆的，終生使用胰島素治療是目前臨床上治療該病的主要措施。然而使用外源胰島素控制血糖的效果受多種因素的影響，這使得患犬的血糖容易出現(xiàn)大范圍波動(dòng)，需要定期檢查、長(zhǎng)期監(jiān)控，這些都非常消耗獸醫(yī)與主人的時(shí)間和精力。

2012年，Kim等[30]成功將皮膚來(lái)源的MSCs誘導(dǎo)分化為功能性胰島素生成細(xì)胞(IPC)，為治療1型糖尿病提供了可能的β細(xì)胞來(lái)源。國(guó)內(nèi)還有學(xué)者通過(guò)動(dòng)脈介入技術(shù)，將導(dǎo)入了人胰島素(INS)基因的犬BMSCs注射到糖尿病患犬的肝內(nèi)，結(jié)果顯示，該方法可以有效降低患犬血糖濃度，且肝臟病理切片也未檢測(cè)到腫瘤的形成[31]。在此技術(shù)基礎(chǔ)上，王麗梅等[32]將自體BMSCs移植到患犬胰腺內(nèi)，結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，治療組的胰島素使用量有所減少，在胰腺和腎臟內(nèi)都檢測(cè)到了BMSCs，病理切片也未顯示任何異常改變。因此，利用MSCs的特性使機(jī)體恢復(fù)胰島素分泌功能的這種替代療法，可以作為臨床治療1型糖尿病的新思路。

3 展望

綜上所述，干細(xì)胞療法是一種較安全的方法，其中最具潛力的干細(xì)胞是MSCs，因?yàn)樗鼈兡軌虼龠M(jìn)組織修復(fù)、激活細(xì)胞因子分泌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、釋放歸巢信號(hào)。通過(guò)對(duì)犬間充質(zhì)干細(xì)胞的研究和臨床應(yīng)用，可能為目前獸醫(yī)臨床上難以解決的病癥提供有效的治療手段，為未來(lái)寵物疾病治療提供一個(gè)新的發(fā)展方向。

雖然干細(xì)胞療法有巨大的臨床應(yīng)用潛力，但有必要進(jìn)一步研究證實(shí)該方法對(duì)寵物臨床患者的療效確實(shí)性。因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室對(duì)MSCs的處理不盡相同，無(wú)法保證其同質(zhì)性；對(duì)MSCs的基礎(chǔ)性研究也不夠系統(tǒng)和全面。所以制定規(guī)范的MSCs培養(yǎng)方案、探索其作用機(jī)制、優(yōu)化臨床治療方案、避免副作用、建立寵物干細(xì)胞產(chǎn)品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，對(duì)于MSCs廣泛應(yīng)用于寵物臨床都是需要盡快解決的問(wèn)題。這都需要更多優(yōu)秀的科研工作者和寵物醫(yī)生對(duì)寵物干細(xì)胞進(jìn)行更深入的研究，為寵物臨床奠定理論基礎(chǔ)，提供技術(shù)保障，從而更好更快地推進(jìn)寵物行業(yè)的發(fā)展。