禽逆轉(zhuǎn)錄病毒防控新思路：CRISPR/Cas9

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV）是一種感染禽類的免疫抑制性、致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒，它可引起雞、鴨、火雞和其他禽類發(fā)生矮小綜合征和慢性腫瘤，導(dǎo)致嚴(yán)重免疫抑制。當(dāng)前REV 在我國流行非常嚴(yán)重，是威脅我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。REV 不僅可以發(fā)生單獨(dú)感染，該病毒與其他禽類病毒混合感染的現(xiàn)象也十分普遍，這進(jìn)一步增加了防控的難度。REV 與雞馬立克氏病病毒（MDV）的混合感染以及重組不僅能夠增強(qiáng)MDV 的致病性，還加劇了MDV 的不斷變異。然而到目前為止，世界上還沒有商品化疫苗用于REV 的預(yù)防，也沒有行之有效的雞群凈化措施。

CRISPR/Cas9 是近年來出現(xiàn)的一種新型基因編輯技術(shù)，現(xiàn)已廣泛用于動(dòng)物、植物和微生物的基因組編輯，在持續(xù)感染的病毒或潛伏感染病毒疾病治療中具有重大的潛在應(yīng)用價(jià)值。近期發(fā)表于《Molecular Therapy-Nucleic Acids》上的研究顯示，一種以MDV 血清1 型弱毒疫苗814 株為載體遞呈的靶向REV 的CRISPR/Cas9 能夠預(yù)防REV 對雞的感染，并對感染雞體內(nèi)的REV 具有一定的清除作用。這種基于CRISPR/Cas9 技術(shù)設(shè)計(jì)的靶向REV 基因組的新型疫苗為REV 的防控提供了一種新思路。

該研究首先設(shè)計(jì)了靶向REV 基因組序列的向?qū)NA（gRNA）以及Cas9 表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建了可編輯REV 基因組的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，靶向REV 的CRISPR/Cas9 在體外細(xì)胞水平能夠阻止REV感染宿主細(xì)胞，同時(shí)對REV 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中的REV前病毒DNA 具有一定的清除作用。在此基礎(chǔ)上，將靶向REV 的gRNA 表達(dá)框架以及Cas9 基因表達(dá)框架插入MDV 弱毒疫苗814 株基因組中，構(gòu)建了表達(dá)上述CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的重組MDV。上述構(gòu)建的重組MDV 能夠在感染細(xì)胞中表達(dá)gRNA 和Cas9 蛋白，而且對REV 感染體外宿主細(xì)胞具有明顯抑制作用。進(jìn)一步動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述表達(dá)REV 靶向CRISPR/Cas9 的重組MDV 能夠顯著性降低感染雞體內(nèi)的REV 復(fù)制水平，對REV 感染造成的矮小綜合征和免疫器官萎縮具有明顯預(yù)防作用。

目前國內(nèi)外對禽逆轉(zhuǎn)錄病毒病缺乏有效的疫苗和防控措施，主要通過淘汰凈化種雞群的方法來控制禽逆轉(zhuǎn)錄病毒的流行，但該方法成本高，耗時(shí)長，工作量大且病毒感染易反復(fù)，而且對于我國的商品代雞群以及地方品系雞，完全實(shí)施凈化是非常艱難的。針對逆轉(zhuǎn)錄病毒，傳統(tǒng)意義上基于抗原設(shè)計(jì)的疫苗只能在一定程度上預(yù)防疾病的發(fā)生，很難達(dá)到清除病毒的效果。該研究采用新思路設(shè)計(jì)的靶向REV 基因組的CRISPR/Cas9 疫苗能夠達(dá)到破壞和清除REV 前病毒DNA 的效果，使其失去功能，進(jìn)而從根本上發(fā)揮預(yù)防和凈化作用。另外，該研究采用皰疹病毒為載體，其較大的基因組更利于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的插入和表達(dá)。以MDV 弱毒疫苗株為載體，體內(nèi)遞呈靶向REV 的CRISPR/Cas9，構(gòu)建重組病毒疫苗株，不僅可以作為REV 的預(yù)防和治療手段，還可以對MDV 提供良好的保護(hù)，從而有助于解決REV 和MDV 混合感染的問題。