不同原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠模型的優(yōu)缺點(diǎn)

杜思穎，楊晉輝

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，昆明 650500)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC，又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化)是一種女性易感的自身免疫性疾病，該病發(fā)生隱匿，進(jìn)展緩慢，血清學(xué)檢查可見自身抗線粒體抗體(antimitochondrial antibodies，AMA)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(gammaglutamyl transpeptidase，GGT)升高，病理上以肝內(nèi)膽汁淤積、門脈區(qū)大量淋巴細(xì)胞浸潤、進(jìn)行性膽管上皮細(xì)胞特異性破壞和肉芽腫形成為顯著特征，最終導(dǎo)致廣泛性肝膽管破壞、肝硬化甚至肝衰竭。研究表明，位于線粒體內(nèi)膜上的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2亞基(the E2 subunit of pyruvate dehydrogenase complex，PDC-E2)是AMA識(shí)別的最主要的自身靶抗原，大多數(shù)患者外周血存在有PDC-E2自身反應(yīng)性的T細(xì)胞[1-2]。近幾年來，PBC發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，為了更好的進(jìn)行PBC發(fā)病機(jī)制及炎癥進(jìn)程的研究，尋求新的治療突破口，需要一個(gè)理想的PBC動(dòng)物模型。本文的目的是分析比較幾種應(yīng)用較廣泛的PBC小鼠模型的優(yōu)缺點(diǎn)，探討目前的模型在疾病研究中存在的缺陷，為研究者模型選擇提供更多的依據(jù)。

1 誘導(dǎo)性模型

1.1 2-辛炔酸(2-octynoic acid，2OA)誘導(dǎo)的小鼠模型

有研究指出，來自PBC患者的自身AMA不僅可與天然脂質(zhì)化的PDC-E2交叉反應(yīng)，而且還和許多與硫辛酰具有相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)異生模擬物交叉反應(yīng)，其中以2-辛炔酸(2OA)為典型，PBC患者血清顯示出對(duì)2-辛炔酸-PDC-E2肽的高Ig反應(yīng)性，提示這種化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)具有修飾PDC-E2的潛力，是能夠被AMA識(shí)別的半抗原[3-5]。在此基礎(chǔ)上，Wakabayashi等[6]用2OA結(jié)合牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)來免疫C57BL/6小鼠和NOD.1101小鼠，皆成功誘導(dǎo)出了類似人PBC的病變，這兩種被誘導(dǎo)的小鼠都表現(xiàn)出自身免疫性膽管炎，典型的自身AMA，血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factoR-α，TNF-α)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)升高，肝門靜脈區(qū)域CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞浸潤，肝內(nèi)小膽管損傷等病理特點(diǎn)，但NOD.1101小鼠出現(xiàn)AMA的時(shí)間比C57BL/6小鼠更早，在疾病的第二周開始就可觀察到，而且NOD.1101小鼠的門脈區(qū)除CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞外，還可見中性粒細(xì)胞浸潤及肉芽腫形成，表現(xiàn)出比C57BL/6小鼠更易被外源性物質(zhì)誘發(fā)出PBC樣病變的特性。

總的來說，用2OA誘發(fā)的PBC模型構(gòu)建簡(jiǎn)單，重建性高，病理特點(diǎn)與人PBC相似，但這種小鼠模型的疾病自然史和嚴(yán)重程度不如人類強(qiáng)度高，不包括纖維化改變，并且使用2OA-BSA乳化后腹腔注射可導(dǎo)致不同程度的腹膜炎，這與人PBC有一定差別。此外，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，盡管2OA這種異生素在自然界中不存在，但它可以化學(xué)合成，并且廣泛應(yīng)用于香水、口紅、面霜、肥皂、洗滌劑及一些食品添加劑中，這些數(shù)據(jù)為人類PBC的環(huán)境起源提供了說服力。

1.2 聚肌苷-聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，poly I∶C)誘導(dǎo)的模型

Poly I∶C是1型干擾素誘導(dǎo)物，在結(jié)構(gòu)上類似雙鏈RNA(dsRNA)，是Toll樣受體3(toll-like receptor 3，TLR3)的天然刺激物。研究表明，利用腹腔注射poly I∶C的方法免疫C57BL/6雌性小鼠，可以成功建立PBC模型[7-8]，poly I∶C免疫小鼠后8周，在門靜脈區(qū)可檢測(cè)到單核細(xì)胞，血清AMA陽性小鼠頻率為27.8%；進(jìn)展至16周，血清AMA陽性頻率增加，肝匯管區(qū)明顯炎性細(xì)胞浸潤，浸潤的淋巴細(xì)胞積聚在受損的膽管周圍，血清干擾素-α(interferonα，IFN-α)、ALP水平升高，類似PBC的早期改變。這種模型建造方法簡(jiǎn)單，所用試劑單一，且由于poly I∶C注射，在這些小鼠中檢測(cè)到高水平的IFN-α和其他促炎細(xì)胞因子，受到許多科研工作者的青睞，但該種方法需4個(gè)月才能使小鼠發(fā)展成PBC，血清AMA抗體滴度較低，門靜脈炎癥程度輕，未見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及纖維化或橋接樣壞死改變，不及人類PBC嚴(yán)重，只適用于早期病變的研究。

1.3 2OA與poly I∶C聯(lián)合免疫C57BL/6小鼠模型

基于對(duì)以上兩種造模方法的觀察，加上越來越多的研究表明環(huán)境和/或感染因子可以加劇自身免疫反應(yīng)，故有研究提出，運(yùn)用2OA與poly I∶C聯(lián)合免疫是否會(huì)改變疾病進(jìn)程?為了驗(yàn)證這一假說，Ambrosini等[9]人使用這兩種藥物進(jìn)行了聯(lián)合免疫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與2OA免疫組比，聯(lián)合免疫組中poly I∶C給藥加劇了2OA免疫小鼠肝中的自身免疫性膽管炎，包括CD8+T淋巴細(xì)胞以及血清IL-6、IL-12、IFNγ、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的顯著增加，更為重要的是，該種模型有纖維化證據(jù)，肝組織學(xué)檢查可見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和橋接樣纖維化改變，與人PBC組織學(xué)表現(xiàn)非常相似。與單獨(dú)用2OA免疫組和單獨(dú)用poly I∶C免疫組相比，這種聯(lián)合免疫小鼠的實(shí)驗(yàn)方法較為復(fù)雜，且同樣會(huì)并發(fā)腹膜炎，但該種實(shí)驗(yàn)方案周期短(8周)，血清內(nèi)AMA抗體滴度高，肝病理學(xué)檢查有纖維化改變，可用于PBC早期及晚期病程的研究。2OA與poly I∶C聯(lián)合免疫小鼠成功建立PBC模型的事實(shí)說明，PBC疾病的發(fā)生除了自我耐受性的破壞之外，還需要在疾病進(jìn)程中產(chǎn)生第二次“命中”，符合自身免疫性疾病的“多重打擊”假說，更真實(shí)的模仿了人類PBC疾病。

1.4 抗線粒體抗體M2抗原誘導(dǎo)的小鼠模型

PBC特征性的血清學(xué)指標(biāo)是自身AMA的出現(xiàn)，也是PBC患者最早出現(xiàn)的變化之一，甚至在發(fā)病前即可檢測(cè)到[10-11]。AMA一共有M1-M9九個(gè)亞型，其中只有M2型為PBC特異性抗體，M2的靶抗原是2-氧代酸脫氫酶復(fù)合體的一些組分，主要包括PDC-E2，OGDC-E2和BCOADC-E2三種?？咕€粒體抗體M2抗原誘導(dǎo)的模型是指利用基因工程的方法克隆表達(dá)M2型抗體的3個(gè)靶抗原，并將其連接成抗原蛋白三聯(lián)體，免疫C57BL/6小鼠建成的模型[12]。這種小鼠模型非常容易誘導(dǎo)出針對(duì)M2型自身抗原的抗體，血清AMA抗體滴度高，ALP水平增加，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)無明顯變化；胃、肌肉和腎組織沒有明顯的損傷，而肝有明顯的病理變化，包括膽管周圍單個(gè)核細(xì)胞浸潤，膽管上皮細(xì)胞變性壞死，基底膜不完整，小葉間膽管損傷或增生等，符合PBC的肝特異性改變。雖然這種模型免疫后66周才觀察到病變，與人PBC的慢性進(jìn)程一致，但該種方法耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)要求高，沒有纖維化形成，且建成PBC模型時(shí)小鼠年齡已太老，無法進(jìn)行下一步的觀察或治療研究，限制了該模型的廣泛使用。

2 基因修飾模型

2.1 dnTGF-βRII小鼠模型

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βII型受體顯性失活型(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type II，dnTGF-βRII)小鼠模型是在CD4啟動(dòng)子的控制下，轉(zhuǎn)基因小鼠過表達(dá)TGF-βII型受體(TGF-βRII)的顯性失活形式，自發(fā)地出現(xiàn)PBC樣損傷[13]。該模型很好地模擬了人PBC的幾個(gè)關(guān)鍵特征，包括自發(fā)產(chǎn)生AMA、100% AMA陽性、門靜脈內(nèi)有廣泛的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤、血清IFN-γ和TNF-α水平升高以及肝內(nèi)小膽管損傷等。在眾多模型中，dnTGF-βRII小鼠模型是具有與PBC最接近的血清學(xué)特征的模型，被廣泛使用[14]。同時(shí)我們也不能忽視dnTGF-βRII小鼠模型尚存在的缺陷:第一，該方法沒有顯示出dnTGF-βRII小鼠患PBC的女性優(yōu)勢(shì)特征，缺少雌性小鼠動(dòng)物模型；第二，TGF-β是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其可誘導(dǎo)來自幼稚CD4前體細(xì)胞的Foxp3+Treg的發(fā)展，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育以及抑制主要免疫性細(xì)胞而促進(jìn)調(diào)節(jié)性細(xì)胞的生成方面發(fā)揮重大的作用，該模型TGF-β信號(hào)的缺失引起了其他疾病的出現(xiàn)，如炎癥性腸病、壽命期縮短等；第三，dnTGF-βRII小鼠并不表現(xiàn)出循環(huán)IgM的持續(xù)增加，相反，它表現(xiàn)出IgA的增加；第四，不存在嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和肉芽腫形成。另外，dnTGF-βRII小鼠自發(fā)出現(xiàn)這些PBC樣損傷表明TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的缺乏或異?；罨瘏⑴c了PBC的發(fā)病機(jī)理并導(dǎo)致了免疫調(diào)節(jié)失衡和自身耐受性的喪失，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.2 IL-2Rα(CD25)-/-小鼠模型

IL-2是具有多種生物活性的細(xì)胞因子，其與IL-2R結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)有助于維持體內(nèi)T細(xì)胞耐受，調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和抑制功能[15]。白細(xì)胞介素2受體α(IL-2Rα/CD25)表達(dá)缺陷的小鼠外周血中Treg細(xì)胞減少，且產(chǎn)生的特異性AMA可結(jié)合到PDC-E2內(nèi)部的脂酰結(jié)構(gòu)域，與人PBC一致，除此之外，該模型小鼠還表現(xiàn)出100% AMA陽性，80%ANA陽性，血清IFN-γ、TNF-α、IL-2水平增加，肝匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤，輕度膽管破壞和界面性肝炎等癥狀[10，16]，符合PBC樣損傷特征。值得注意的是，IL-2Rα(CD25)-/-小鼠模型沒有顯示出嗜酸性粒細(xì)胞增加和肉芽腫形成，也沒有提及血清內(nèi)膽紅素和膽汁酸的改變，而且還出現(xiàn)了其他類型的自身免疫性疾病，包括淋巴組織增生性自身免疫性疾病、炎癥性腸病和溶血性貧血等，這也是此種小鼠壽命較短的原因，大多數(shù)小鼠在出現(xiàn)嚴(yán)重的肝病變之前都因發(fā)生重度貧血死亡，不利于進(jìn)行PBC晚期病變的研究，而且非PBC特異性模型。

2.3 NOD.c3c4小鼠模型

在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型的研究過程中發(fā)現(xiàn)，將染色體3和4上的胰島素依賴性糖尿病阻抗位點(diǎn)B6/B10重組入NOD小鼠內(nèi)，可阻止1型糖尿病發(fā)生并且出現(xiàn)伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤的自身免疫性膽管疾病，因此將這種小鼠命名為NOD.c3c4小鼠。這種小鼠在第8～9周即開始產(chǎn)生自身AMA且可特異性的與PDC-E2的內(nèi)部硫辛酰結(jié)構(gòu)域結(jié)合，血清學(xué)檢查可見50%～60% AMA陽性，80%～90%ANA陽性；在顯微鏡下，NOD.c3c4小鼠表現(xiàn)出特定的肝病變，包括上皮樣肉芽腫形成，NSDC樣病變，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和早期纖維化，受累的膽管上皮中有CD3+，CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤等，符合PBC征象[17]。值得一提的是，NOD.c3c4小鼠不僅存在肝內(nèi)膽管的非化膿性膽管炎樣損傷，同時(shí)還累及肝外膽管，90%的小鼠在30周時(shí)會(huì)出現(xiàn)肝外膽管囊性擴(kuò)張，當(dāng)膽管擴(kuò)張到一定程度，膽管上皮細(xì)胞就會(huì)脫落，最后發(fā)展為致死性的膽道梗阻[17-18]，與人PBC不符。

2.4 Scurfy小鼠模型

Scurfy小鼠即Foxp3基因突變的小鼠。Foxp3是Treg細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，是由nTregs獨(dú)特表達(dá)并且是其發(fā)育所必需的，因此Foxp3基因的突變或消失將會(huì)嚴(yán)重影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞主動(dòng)維持自身免疫耐受的功能，最終導(dǎo)致免疫失調(diào)和自身免疫性疾病的發(fā)生[19-21]。在Scurfy小鼠中，由于編碼轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的基因移碼突變，使Foxp3+Treg細(xì)胞功能完全缺陷，最后自發(fā)地發(fā)展出PBC樣病變。Scurfy小鼠在第3～4周時(shí)就顯示出100% AMA陽性，血清內(nèi)TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23細(xì)胞因子顯著升高，肝匯管區(qū)有中度至重度淋巴細(xì)胞浸潤，肝內(nèi)小膽管損傷等特點(diǎn)[22]。遺憾的是，該模型并沒有提及有關(guān)膽汁淤積的指標(biāo)，且此種小鼠壽命極短，僅有4周左右，雄性小鼠沒有生育能力，不利于進(jìn)行PBC進(jìn)展相關(guān)的機(jī)制研究。

2.5 Ae2a，b-/-小鼠模型

Cl-/HCO3-陰離子轉(zhuǎn)換器2(Cl-/HCO3-anion exchanger 2，Ae2)是具有細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)和跨上皮酸-堿轉(zhuǎn)運(yùn)功能的離子通道，能夠幫助促胰液素刺激的膽汁碳酸氫鹽有效排泄[23]，Ae2a，b-/-小鼠即Cl-/HCO3-陰離子轉(zhuǎn)換器2基因敲除的小鼠。該模型小鼠大約有三分之一表現(xiàn)出廣泛的門脈炎癥，約有80%出現(xiàn)AMA陽性，效應(yīng)性T細(xì)胞增多，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少，血清IL-12和IFN-γ分泌明顯，IgM、IgG及ALP顯著增加，表現(xiàn)出PBC的一些特征[24]。與人不同的是，這種小鼠具有自發(fā)脾大的現(xiàn)象，伴有脾細(xì)胞內(nèi)pH升高，小鼠個(gè)體間差異大，門靜脈炎癥有輕度到重度不等，且很難飼養(yǎng)，對(duì)PBC研究有一定的局限性。但同時(shí)應(yīng)注意，Ae2a，b-/-小鼠模型的建立提示了Ae2在膽管功能和免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中的作用，為PBC的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)新的線索，也為新的免疫調(diào)節(jié)策略提供新思路。

綜上所述，PBC樣肝病變雖然能在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)，但無論哪一種誘導(dǎo)模型都存在一定的缺陷，這是由于人類PBC復(fù)雜而神秘的病因難以被完全復(fù)刻，且不能排除人PBC中涉及的參與因子可能不存在或不能在小鼠模型中持續(xù)模仿，這使得PBC模型建造面臨巨大的挑戰(zhàn)。盡管已有研究報(bào)道了在18～24個(gè)月時(shí)超過一半的雌性C57BL/6小鼠在肝中可自發(fā)的發(fā)展出PBC樣膽管炎病變[25]，但這種自然發(fā)生PBC的小鼠模型發(fā)現(xiàn)病變時(shí)年齡已太老，不利于長(zhǎng)期進(jìn)行研究，也無法測(cè)試新藥和新治療方案的效果，難以被廣泛使用。目前，雖然已有相當(dāng)多的科學(xué)證據(jù)揭示了PBC獨(dú)特的臨床，實(shí)驗(yàn)室，免疫學(xué)和組織形態(tài)學(xué)特征，但由于PBC患者長(zhǎng)期無癥狀，其早期免疫事件及發(fā)病機(jī)制仍然模糊不清，迄今尚未尋找到可以徹底治愈PBC的方法，熊去氧膽酸作為PBC的一線治療，能明顯降低ALP水平，提高患者生存率和降低肝移植的必要性，但超過1/3的患者治療無應(yīng)答[26]，因此，積極尋找建立無限接近于人PBC的動(dòng)物模型，進(jìn)行PBC早期細(xì)胞和分子事件研究及創(chuàng)新治療策略的開發(fā)仍然是科研工作者們努力的方向。