胰高血糖素樣多肽-1對肺臟炎癥的抑制作用研究進(jìn)展

白 玉， 趙立紅， 連朋敬， 李靜云， 喬 健

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京海淀100193)

胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)是由胰高血糖素(GCG)基因編碼的一種分泌型多肽，具有誘導(dǎo)胰島素分泌、降血糖、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抵抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)功能。由于GLP-1在體內(nèi)半衰期極短，易被降解，因此科學(xué)家開發(fā)出具有較長半衰期的GLP-1多肽分子相似物——胰高血糖素樣多肽-1受體激動(dòng)劑(GLP-1Ra)，并將其作為治療2型糖尿病(T2DM)的藥物，現(xiàn)已上市。GLP-1和GLP-1Ra除用作治療T2DM外，還具有抑制多種組織器官炎癥的作用。本文就GLP-1和GLP-1Ra抑制肺臟炎癥作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步探討GLP-1或GLP-1Ra作為抗肺炎藥物的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 胰高血糖素樣多肽-1的生物合成及其釋放

胰高血糖素樣多肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是由胰高血糖素(Glucagon，GCG)基因編碼的一種分泌型多肽，早在20世紀(jì)80年代科學(xué)家已經(jīng)克隆出GCG基因，并發(fā)現(xiàn)其編碼多種多肽分子。GCG基因含6個(gè)外顯子(E1～E6)，它們分別編碼腸高血糖素相關(guān)胰腺多肽(Glicentin-related pancreatic polypeptide，GRPP)、胰高血糖素(GCG)、GLP-1、胰高血糖素樣多肽-2(Glucagon like peptide-2，GLP-2)以及信號(hào)肽等不同種類的多肽分子[1]。GCG基因被翻譯成多種不同多肽分子的過程為：首先GCG基因在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄GCGmRNA，后者通過核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，在核糖體上以GCGmRNA為模板翻譯出長度為180個(gè)氨基酸的胰高血糖素原(Proglucagon)[2]，胰高血糖素原在不同器官或細(xì)胞中被激素原轉(zhuǎn)化酶(Prohormone convertase，PC)切割成不同的多肽分子后，再分泌到細(xì)胞外，其中，在胰腺內(nèi)胰高血糖素原被激素原轉(zhuǎn)化酶2(PC 2)切割成GRPP和GCG再分泌到胞外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道中胰高血糖素原被激素原轉(zhuǎn)化酶1/3(PC 1/3)切割成胃泌酸調(diào)節(jié)素(Oxyntomodulin)、GLP-1和GLP-2，在胞質(zhì)中GLP-1的C端或N端進(jìn)一步分別被切割掉6個(gè)或1個(gè)氨基酸后形成有活性的GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)形式再被分泌到胞外，有活性的GLP-1與胰高血糖素樣多肽-1受體(Glucagon like peptide-1 receptor，GLP-1R)結(jié)合激活下游細(xì)胞信號(hào)通路，從而行使生物學(xué)功能[3]。

2 胰高血糖素樣多肽-1的結(jié)構(gòu)組成及其主要生物學(xué)功能

GLP-1是由37個(gè)氨基酸組成的多肽分子(中插彩版圖1A)，GLP-1的第1～6位或第37位氨基酸被酶切掉修飾生成2種活性形式，即GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)，其中前者是體內(nèi)存在的主要形式。當(dāng)活性形式的GLP-1與受體結(jié)合并激活下游通路后，其第1～2位氨基酸(GLP-1全長的第7～8位氨基酸)被酶切掉修飾成無活性的GLP-1，即GLP-1(9-36)和GLP-1(9-37)。由于GLP-1(7-36)僅由30個(gè)多氨基酸組成，其天然構(gòu)象雖然僅為連續(xù)的α-螺旋結(jié)構(gòu)(中插彩版圖1B)，但具有多種生物學(xué)功能，是生命過程中不可缺少的一種激素。

胰高血糖素多肽-1受體(GLP-1R)是一種七跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)的B類G蛋白偶聯(lián)受體(B-GPCR)[4]，其氨基酸序列的N端位于細(xì)胞膜外側(cè)，有6個(gè)半胱氨酸位于N末端，其與配體的結(jié)合有密切關(guān)系，N端氨基酸序列被糖基化修飾后使GLP-1R結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；其氨基酸序列的C端位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，與α、β和γ亞基三聚體結(jié)構(gòu)的G蛋白組成GLP-1R-Gs復(fù)合體[2]。靜息狀態(tài)時(shí)，GLP-1R-Gs復(fù)合體中的G蛋白與GDP結(jié)合，當(dāng)活性形式GLP-1與GLP-1R的N端結(jié)合后，GLP-1R被激活，在Mg2+參與下，誘導(dǎo)與G蛋白結(jié)合的GDP與胞質(zhì)中GTP交換形成GTP-αβγ結(jié)構(gòu)，然后GTP-α與βγ分離，游離的GTP-α激活胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase，AC)，AC催化腺苷酸環(huán)化生成第二信使cAMP并變構(gòu)激活蛋白激酶(Protein kinase，PK)A，活化后的PKA激活絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、CHOP等功能蛋白發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)功能[5]；與此同時(shí)，GLP-1被酶切割成無活性形式并與GLP-1R分離，而α亞單位本身具有GTP水解酶活性，促使GTP-α釋放Pi形成GDP-α，后者再與βγ亞單位形成GDP-αβγ形式而恢復(fù)到靜息狀態(tài)[2]。

GLP-1(7-36)與GLP-1R互作后通過cAMP信號(hào)通路激活PKA和Gadd34蛋白以減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明，GLP-1(7-36)通過高表達(dá)Bcl-2蛋白降低機(jī)體在病理情況下細(xì)胞凋亡數(shù)量[6]。有資料顯示，GLP-1(7-36)能有效提高血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和減少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，在機(jī)體內(nèi)還能修復(fù)受損的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)保證血管的完整性[7]。核因子(Nuclear factor，NF)-κB能調(diào)控細(xì)胞因子和趨化因子等多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，GLP-1(7-36)與GLP-1R互作后通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制NF-κB的磷酸化，細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)磷酸化NF-κB會(huì)降低促炎因子的表達(dá)，最終抑制炎癥反應(yīng)。Epac2蛋白是調(diào)控胰島素分泌的關(guān)鍵蛋白，在胰島β細(xì)胞中GLP-1(7-36)通過調(diào)節(jié)Epac2蛋白活性促進(jìn)胰島素分泌。

3 GLP-1和GLP-1Ra與肺臟炎癥

近些年科學(xué)家相繼發(fā)現(xiàn)，GLP-1(7-36)能夠抑制多種組織器官的炎癥，尤其對呼吸系統(tǒng)炎癥的抑制作用更加明顯，故GLP-1有望被開發(fā)成為一種抑制肺臟炎癥的靶向藥物[8]。因GLP-1(7-36)在體內(nèi)能被血管內(nèi)皮上的二肽酰肽酶-Ⅳ(Dipeptidylpeptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ)很快降解并失去其生物學(xué)功能，導(dǎo)致GLP-1在體內(nèi)的半衰期不超過2 min；因此，科學(xué)家運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段制備出與GLP-1(7-36)具有高度同源性且生物學(xué)功能相近的GLP-1Ra，其中同源性最高且在科學(xué)研究和臨床中最常用的是利拉魯肽，其34位點(diǎn)由賴氨酸取代精氨酸，并通過谷氨酸間隔子在第26位賴氨酸上增加了1個(gè)16-碳棕櫚酰脂肪酸側(cè)鏈，這些改變不僅降低其被DPP-Ⅳ的降解作用，還增強(qiáng)了與受體的親和力[1]。GLP-1Ra同樣可與GLP-1R結(jié)合激活相同的下游通路，且GLP-1Ra的體內(nèi)半衰期明顯延長，可長達(dá)13 h。有研究發(fā)現(xiàn),小鼠肺臟中GLP-1R表達(dá)量顯著高于腦、腸道和腎臟等器官[9]，結(jié)果提示,GLP-1R可能是治療肺炎等肺臟疾病的重要靶點(diǎn)之一。

3.1 GLP-1和GLP-1Ra與非感染性肺炎 運(yùn)用低劑量卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)長期持續(xù)刺激小鼠呼吸道能夠誘導(dǎo)小鼠發(fā)生非感染性肺炎，有學(xué)者對OVA誘導(dǎo)的肺炎病理模型小鼠多次注射利拉魯肽后，經(jīng)病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，注射利拉魯肽小鼠肺炎發(fā)病程度、呼吸道內(nèi)黏液分泌量明顯減少，以及肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)量和蛋白質(zhì)濃度均低于未注射利拉魯肽小鼠，上述結(jié)果表明，利拉魯肽可有效減輕肺炎發(fā)病程度并制止肺泡的炎性滲出。OVA主要通過高表達(dá)磷酸化NF-κB誘導(dǎo)肺炎的發(fā)生，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)給OVA誘導(dǎo)的肺炎小鼠注射利拉魯肽后，其肺臟中磷酸化NF-κB表達(dá)量較未注射小鼠明顯降低；運(yùn)用H-89(PKA抑制劑)處理OVA誘導(dǎo)的肺炎小鼠模型后，利拉魯肽抑制肺臟炎癥的作用減弱，磷酸化NF-κB表達(dá)量較未用H-89組明顯增加，該結(jié)果進(jìn)一步證明，利拉魯肽是通過PKA/NF-κB途徑抑制OVA誘導(dǎo)的非炎癥性肺炎[5]。運(yùn)用適宜濃度的OVA加LPS多次吸入式刺激雌性小鼠可誘導(dǎo)雌性小鼠發(fā)生慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，再對該病理模型小鼠多次注射利拉魯肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在刺激后第21天時(shí)注射利拉魯肽小鼠未見小鼠死亡，而未注射利拉魯肽小鼠死亡率高于50%，表明利拉魯肽能有效降低因COPD引起的小鼠死亡風(fēng)險(xiǎn)[9]。靜態(tài)肺功能指數(shù)是衡量肺臟功能的重要指標(biāo)之一，靜態(tài)肺功能指數(shù)越小，表明肺臟功能越好，對COPD模型小鼠注射利拉魯肽后，測定小鼠靜態(tài)肺功能指數(shù)發(fā)現(xiàn)，注射利拉魯肽小鼠靜態(tài)肺功能指數(shù)明顯小于未注射小鼠，此結(jié)果說明利拉魯肽能提高小鼠靜態(tài)肺功能，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),注射利拉魯肽小鼠肺臟炎癥的發(fā)病程度明顯低于未注射利拉魯肽小鼠，主要表現(xiàn)為注射利拉魯肽小鼠的肺泡中炎性細(xì)胞數(shù)量和蛋白滲出量明顯少于未注射小鼠[9]。動(dòng)物患肺炎時(shí)，其肺泡灌洗液和肺臟中細(xì)胞因子和趨化因子分泌量明顯增多，給肺炎小鼠多次注射GP-1Ra后，IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量明顯減少，說明GLP-1Ra可有效抑制肺炎發(fā)生時(shí)細(xì)胞因子的生物合成[10]。巨噬細(xì)胞在肺臟炎癥的發(fā)病過程中扮演重要角色，巨噬細(xì)胞被刺激后能夠分化成為Ⅰ型和Ⅱ型巨噬細(xì)胞，其中Ⅰ型巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，如IL-1β和TNF-α等；而Ⅱ型巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子，如IL-10等，肺炎時(shí)肺臟固有巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞均表現(xiàn)為Ⅰ型表型并分泌大量促炎因子，加重肺炎發(fā)病程度以及伴有嚴(yán)重的急性肺損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1能誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，即從Ⅰ型表型轉(zhuǎn)化為Ⅱ型表型以及分泌抑炎因子—IL-10 等，并且在0.5～30 nmol/L濃度范圍內(nèi)，GLP-1對巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化呈現(xiàn)劑量依賴性特點(diǎn)，但抑制STAT3磷酸化后，GLP-1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)功能將減退或消失，此結(jié)果說明GLP-1通過p-STAT3通路將Ⅰ型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Ⅱ型巨噬細(xì)胞[11]，由此推斷GLP-1可能通過將Ⅰ型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Ⅱ型巨噬細(xì)胞從而發(fā)揮抑制肺臟炎癥的作用。肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷往往可誘導(dǎo)急性肺損傷的發(fā)生，而急性肺損傷多伴有嚴(yán)重肺臟炎癥的發(fā)生，GLP-1Ra能減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷以及保持血管內(nèi)皮細(xì)胞活力，最終使肺臟炎癥也隨之減輕[3]。

3.2 GLP-1和GLP-1Ra與感染性肺炎 呼吸合胞體病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)能誘導(dǎo)小鼠肺部發(fā)生Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)以及IL-13和IL-33等細(xì)胞因子大量分泌，有研究者運(yùn)用9×105PFU數(shù)量的RSV感染BALB/c小鼠后，能夠誘導(dǎo)小鼠發(fā)生明顯的Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)，再對感染小鼠持續(xù)多天注射利拉魯肽后發(fā)現(xiàn)，其肺泡灌洗液中不但細(xì)胞總數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞、IL-13+ILC2細(xì)胞及IL-33+嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量比未注射利拉魯肽小鼠明顯減少，而且IL-13和IL-33分泌量也明顯降低，糖原染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射利拉魯肽小鼠的呼吸道中黏液分泌量也明顯降低，但病毒載量和IFN分泌量未見明顯變化，此結(jié)果提示利拉魯肽能減輕RSV誘導(dǎo)的小鼠肺臟Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)[12]，此研究首次報(bào)告GLP-1Ra能抑制病毒引起的肺臟炎癥，但其抑制炎癥的分子機(jī)制迄今沒有闡述。鏈格孢菌感染小鼠后能引起小鼠肺臟中IL-33、IL-5、IL-13、CCL11、CCL17等細(xì)胞因子和趨化因子大量釋放以及肺泡灌洗液中ILC2細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及CD45-EpCAM+肺上皮細(xì)胞數(shù)量增多，對鏈格孢菌感染小鼠連續(xù)多次注射利拉魯肽后發(fā)現(xiàn)，小鼠肺泡灌洗液中CD45-EpCAM+肺上皮細(xì)胞、ILC2細(xì)胞總數(shù)、IL-5+ILC2細(xì)胞數(shù)以及IL-13+ILC2細(xì)胞數(shù)比未注射利拉魯肽小鼠均明顯減少(P<0.05)，與此同時(shí)，IL-13、IL-5、IL-9以及CCL-22等細(xì)胞因子和趨化因子均明顯減少(P<0.05)，上述試驗(yàn)結(jié)果均表明，利拉魯肽能有效減輕鏈格孢菌引起的肺臟炎癥反應(yīng)[8,13]。當(dāng)病原微生物侵入肺臟后，模式識(shí)別受體識(shí)別病原微生物并激活NF-κB信號(hào)通路而誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)，引起大量細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，對肺炎小鼠注射GLP-1Ra后，GLP-1Ra能夠與細(xì)胞膜表面的GLP-1R結(jié)合并通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制NF-κB的磷酸化以減少細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，從而緩解或抑制肺炎發(fā)生[6,14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂和蛋白質(zhì)不能正確折疊，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，從而使其生理功能紊亂的過程。病毒侵入宿主后能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以抵抗病毒的復(fù)制，與此同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能引起宿主發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，而GLP-1或GLP-1Ra可通過PKA/Gadd34通路降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)強(qiáng)度并抑制eIF2α的磷酸化，從而減少促炎因子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終降低或抑制宿主的炎癥反應(yīng)[15]。細(xì)菌、病毒或支原體等生物性因素感染宿主肺臟后因其能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起宿主肺臟細(xì)胞氧化—抗氧化平衡被打破而產(chǎn)生大量ROS，其結(jié)果是誘導(dǎo)宿主發(fā)生不同程度的肺損傷和炎癥反應(yīng)，而GLP-1和GLP-1Ra能顯著降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平以減弱由病毒、細(xì)菌或支原體引起的肺損傷或肺炎等[6]。

4 小結(jié)與展望

GLP-1或GLP-1Ra與GLP-1R結(jié)合后通過激活下游PI3K/Akt信號(hào)通路抑制NF-κB磷酸化，進(jìn)而使多種細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)降低以減輕肺臟炎癥反應(yīng)。GLP-1或GLP-1Ra還能通過降低肺臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和恢復(fù)氧化—抗氧化系統(tǒng)平衡抑制肺臟炎癥反應(yīng)。GLP-1Ra如利拉魯肽、安塞多肽等通過化學(xué)修飾后，其分子結(jié)構(gòu)和理化性狀等比GLP-1更加穩(wěn)定，且不易被降解。目前，GLP-1Ra—利拉魯肽作為治療T2DM藥物已經(jīng)上市，且效果較好。由于其還具有抗炎作用，尤其對長期慢性炎癥具有良好的抑制效果，而肺臟中GLP-1R表達(dá)量均高于其他器官，所以GLP-1Ra有望被開發(fā)成為一種抗肺炎藥物。但目前仍有多個(gè)問題有待進(jìn)一步深入探討，如：GLP-1Ra生產(chǎn)成本較高；較大劑量的GLP-1Ra作用中樞神經(jīng)系統(tǒng)后能抑制食欲，使體重減輕[8]；長期較大劑量使用GLP-1Ra可造成低血糖癥[1]；對GLP-1和GLP-1Ra抗炎作用的機(jī)制仍不是十分清楚，而可供臨床研究的案例少之又少，所以對GLP-1和GLP-1Ra作用機(jī)制的深入探究帶來不便。但隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，以上科學(xué)問題定會(huì)被徹底解決，并為其作為抗肺炎藥物的研發(fā)提供依據(jù)。