調(diào)控乳蛋白合成信號(hào)通路的研究進(jìn)展

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642）

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生活水平的提高，人們對(duì)膳食營(yíng)養(yǎng)的要求也不斷上升。牛奶作為天然的食品，一直以來(lái)都是人們攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的首選[1]。乳蛋白作為牛奶中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅含有各種必需氨基酸，還可以調(diào)節(jié)生理平衡，抵抗高血壓并增加機(jī)體自身免疫力，其在牛乳中的含量已成為衡量乳品質(zhì)的重要指標(biāo)[2]。

如何有效提高乳品中的蛋白含量一直是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。在研究的早期，認(rèn)為通過(guò)增加奶牛日糧中的蛋白質(zhì)含量包括過(guò)瘤胃蛋白的水平，可以增加小腸中的可利用氨基酸的含量，最終達(dá)到提高乳蛋白的目的[3,4]。但是日糧中的蛋白質(zhì)含量不可能無(wú)損耗，而且隨著日糧中蛋白質(zhì)含量的增加，機(jī)體吸收的效率反而會(huì)降低，過(guò)量地添加日糧蛋白質(zhì)大部分都會(huì)隨著糞尿排放掉[5]，并不能有效地提升乳品質(zhì)。關(guān)于如何提高乳品質(zhì)，在動(dòng)物體內(nèi)外已經(jīng)開展了大量的研究，但是關(guān)于細(xì)胞分子方面的產(chǎn)生機(jī)制依舊不太清楚。

伴隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，對(duì)如何調(diào)控乳蛋白合成的研究已逐步轉(zhuǎn)移到相關(guān)基因的表達(dá)和聯(lián)系上[6]。如今已經(jīng)可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞分子水平的研究從一定程度上闡述奶牛的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)制，為提高奶牛產(chǎn)乳量和乳品質(zhì)提供理論依據(jù)。目前，利用分子生物學(xué)手段對(duì)與乳蛋白合成相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行研究已經(jīng)成為乳品研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。而且關(guān)于乳蛋白合成機(jī)制的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但關(guān)于信號(hào)通路如何具體影響乳蛋白合成的機(jī)制仍在進(jìn)一步研究中。本文綜合乳蛋白合成的信號(hào)通路，綜述了其對(duì)乳蛋白合成的調(diào)節(jié)作用及最新研究進(jìn)展，旨在為提高奶牛生產(chǎn)效率提供理論基礎(chǔ)。

1 乳蛋白合成信號(hào)通路

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)關(guān)于乳蛋白的合成通路主要有以下三條：在基因水平上調(diào)控轉(zhuǎn)錄的JAK-STAT信號(hào)通路；調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的mTOR信號(hào)通路；檢測(cè)體內(nèi)氨基酸水平的GCN2-eIF2a信號(hào)通路。

1.1 JAK-STAT信號(hào)通路

JAK作為一種與細(xì)胞因子受體相連的酪氨酸蛋白激酶，在生物體內(nèi)信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用[7]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，目前為止共發(fā)現(xiàn)其有四個(gè)家族成員（JAK1～3和TYK2），他們都具有相似的JAK分子結(jié)構(gòu)[8]。JAK分子內(nèi)包含了7個(gè)結(jié)構(gòu)域：JH1是位于羧基末尾的激酶區(qū)，其具有催化作用，且序列呈現(xiàn)高度保守；JH2與激酶的功能相關(guān)，其是可以抑制活性的假激酶區(qū)，具有間接的催化作用；JH6和JH7是受體結(jié)合區(qū)；其他區(qū)域也在細(xì)胞因子與其受體結(jié)合時(shí)發(fā)揮了一定的作用[9]。

STAT是重要的泌乳信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子，其共有6個(gè)家族成員（STAT1～6），作為JAK的靶蛋白，被JAK活化后的STAT蛋白會(huì)形成二聚體，并將信號(hào)傳遞進(jìn)細(xì)胞核，從而調(diào)控特定基因的表達(dá)。STAT蛋白一般包括一個(gè)與其活化密切相關(guān)的酪氨酸殘基、可以與細(xì)胞因子受體相結(jié)合的SH2結(jié)構(gòu)域、與DNA相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)等重要功能片段[10]。

信號(hào)傳導(dǎo)從細(xì)胞外因子與對(duì)應(yīng)的跨膜受體的結(jié)合時(shí)開始，受體上含有JAK，當(dāng)配體與受體相結(jié)合后會(huì)使JAK空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，JH1遠(yuǎn)離具有抑制活性能力的JH2，JAK被激活，隨后具有酪氨酸激酶活性的JAK會(huì)磷酸化STAT上的酪氨酸殘基和SH2結(jié)構(gòu)域，活化的STAT蛋白立即形成二聚體，然后進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因相結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄[11]。

當(dāng)前在乳腺組織中研究最多的還是JAK2-STAT5，這是蛋白合成在轉(zhuǎn)錄水平的重要信號(hào)通路[12]。通過(guò)對(duì)小鼠乳腺的研究也證實(shí)了催乳素確實(shí)可以激活JAK2，繼而磷酸化STAT5，進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)多種乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄，最終提高了乳蛋白的分泌量[13]。有研究對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中的STAT5a基因的表達(dá)進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄mRNA豐度的下降，若對(duì)STAT5a基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)則會(huì)提高酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄mRNA豐度[14]。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乳清酸性蛋白基因和乳球蛋白基因的啟動(dòng)子附近發(fā)現(xiàn)含有STAT5的GAS特異序列，其是促進(jìn)這些乳蛋白分泌所必需的位點(diǎn)[15]。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，同一種或者不同種細(xì)胞外因子都可能會(huì)產(chǎn)生不同效果，其可能激活不同的JAK激酶，并磷酸化不同的STAT蛋白，導(dǎo)致乳蛋白組成和其含量的變化[16]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，其他激素也可作用于JAK-STAT通路，進(jìn)而調(diào)控乳蛋白的合成[17]。通過(guò)對(duì)泌乳早期的奶牛進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)注射胰島素可增加其產(chǎn)奶量和乳蛋白水平[18]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子等其他泌乳因子也會(huì)對(duì)奶牛乳腺中乳蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用[19]。

細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（SOCS）是JAK-STAT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控子[20]。SOCS3作為一個(gè)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的信號(hào)分子，可能參與各種細(xì)胞過(guò)程。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)SOCS3的過(guò)表達(dá)和抑制都可以調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路的活性并顯著改變?nèi)榈鞍椎暮铣桑琒OCS3是JAK-STAT信號(hào)通路的抑制劑[21]。在乳腺細(xì)胞中，SCOS3不僅可以抑制STAT5，還可以封閉酪蛋白基因的表達(dá)[22]。

JAK-STAT信號(hào)通路是一條復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即使最近這些年在JAK-STAT分子結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制和機(jī)理上的研究已產(chǎn)生了豐碩的成果，但仍有許多方面需進(jìn)一步研究，正確認(rèn)識(shí)JAK-STAT信號(hào)通路對(duì)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶方面起著極為重要的基礎(chǔ)作用。

1.2 mTOR信號(hào)通路

mTOR作為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，屬于磷酸肌醇激酶，在機(jī)體細(xì)胞中廣泛分布，其不僅僅是一種重要的信號(hào)傳遞因子，更在細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[23]。mTOR包含有兩種復(fù)合物：mTORC1和mTORC2[24]，其結(jié)構(gòu)和功能各不相同。mTORC1在激素和生長(zhǎng)因子的作用下，對(duì)蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖等過(guò)程進(jìn)行調(diào)控[25]；而mTORC2則主要對(duì)肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)的構(gòu)建功能進(jìn)行調(diào)控。

1.2.1 mTOR上游信號(hào)通路

1.2.1.1 PI3K-Akt

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）包含一個(gè)p85調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)p110催化亞基。P85亞基氨基端不僅包含一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，而且還有能與SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的脯氨酸富集區(qū)；P110亞基具有和蛋白激酶相似的序列，且其本身含有Ser/Thr蛋白激酶的特征，還具有磷脂酰肌醇激酶的特征[16]。AKT又被稱為蛋白激酶B（PKB)，其也是屬于Ser/Thr蛋白激酶的一種[26]。AKT由氨基末端的調(diào)節(jié)區(qū)（PH）、中間的酶活性區(qū)、羧基末端的調(diào)節(jié)區(qū)（HM）以及負(fù)責(zé)將PH區(qū)與激酶活性區(qū)相連接的鉸鏈區(qū)組成[27]。激素、生長(zhǎng)因子等通過(guò)其與受體的結(jié)合，可以將細(xì)胞內(nèi)的胰島素受體酶解物（IRSI）激活，從而將PI3K激活，然后進(jìn)一步作用于Akt，活化后的Akt可以直接作用于mTOR。

1.2.1.2 LKB1-AMPK

LKB1是一種Ser/Thr蛋白激酶，其結(jié)構(gòu)包括氨基調(diào)節(jié)區(qū)、羧基調(diào)節(jié)區(qū)以及激酶區(qū)。氨基調(diào)節(jié)區(qū)含有一個(gè)核定位序列，使LKB1定位于細(xì)胞核中[28]。LKB1可以通過(guò)磷酸化增強(qiáng)AMPK的活性，進(jìn)而負(fù)反饋調(diào)控乳蛋白翻譯的啟動(dòng)過(guò)程[29]。

AMPK為異源三聚體復(fù)合物，由α、β、γ三個(gè)亞基組成，α亞基包含催化域和上游激酶結(jié)合域，主要負(fù)責(zé)催化功能；γ亞基含有和ATP、ADP和AMP的結(jié)合位點(diǎn)，主要負(fù)責(zé)與核苷酸的結(jié)合；β亞基上含有α亞基和γ亞基的結(jié)合位點(diǎn)，主要負(fù)責(zé)AMPK信號(hào)通路的組合連接[30]。

AMPK作為機(jī)體內(nèi)部的能量感受器，可以準(zhǔn)確感受細(xì)胞內(nèi)能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化，能在細(xì)胞水平，甚至機(jī)體整體水平上調(diào)控代謝能量平衡[31,32]。AMPK對(duì)細(xì)胞內(nèi)AMP濃度的變化較為敏感，當(dāng)感受到細(xì)胞內(nèi)AMP的濃度升高時(shí)，促使其被磷酸化，從而被激活[33]。激活的AMPK不僅能抑制ATP的消耗，儲(chǔ)存能量，而且還能刺激產(chǎn)能的分解代謝，生成更多的ATP。泌乳時(shí)，乳腺需要提供大量能量，AMPK信號(hào)通路此時(shí)便發(fā)揮重要的作用。當(dāng)AMPK感受到體內(nèi)能量不足時(shí)，即開啟生成ATP的代謝途徑，同時(shí)活化的AMPK可對(duì)mTOR及其效應(yīng)器進(jìn)行抑制[34]，并激活eEF2激酶，增加eEF2的磷酸化，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)的合成，降低ATP的損耗，維持能量平衡[35]；當(dāng)體內(nèi)的能量充足時(shí)，ATP即可轉(zhuǎn)化為ADP促進(jìn)乳蛋白的生成[36]。

AMPK作為應(yīng)激性蛋白激酶，其被激活大多發(fā)生在應(yīng)激條件下，除AMP/ATP以外，瘦素、氨基酸等對(duì)AMPK均有調(diào)節(jié)作用[37]。研究發(fā)現(xiàn)，將必需氨基酸添加到奶牛乳腺上皮細(xì)胞中可增加ATP水平，抑制AMPK的激活[38]。在乳腺上皮細(xì)胞中添加乙酸、葡萄糖等能量物質(zhì)可影響AMPK信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控乳蛋白的合成[39]。

1.2.2 mTOR下游信號(hào)通路

mTOR下游信號(hào)通路的直接作用底物是真核細(xì)胞翻譯起始因子結(jié)合蛋白-1（4EBP1）和核糖體蛋白S6激酶（S6K）[40]，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)翻譯過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。mTOR被激活后，可通過(guò)磷酸化4EBP1和S6K1使其活化，S6K1是一種能控制核糖體轉(zhuǎn)錄的激酶，活化后可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯及表達(dá)[41]，eIF4E可特異性識(shí)別并夾住mRNA5’端的帽子結(jié)構(gòu)，促進(jìn)翻譯的起始，而4EBP1是一種翻譯起始抑制子，未磷酸化的4EBP1易與eIF4E結(jié)合，并抑制其活性，當(dāng)4EBP1被磷酸化后，活化的4EBP1從eIF4E脫離下來(lái)，翻譯起始正常形成[42,43]。mTOR可通過(guò)抑制4EBP1的同時(shí)激活S6K[44]，調(diào)控翻譯的起始和蛋白質(zhì)的合成[45]。

研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號(hào)通路協(xié)調(diào)乳蛋白合成翻譯過(guò)程，且氨基酸在其中發(fā)揮著重要的作用[46]。將適量的氨基酸混合物添加到乳腺組織培養(yǎng)液中可提升50%左右的乳蛋白含量[47]。Moshel等[48]和Appuhany等[49]通過(guò)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亮氨酸和異亮氨酸可以通過(guò)mTOR信號(hào)通路磷酸化S6K1和4EBP1，從而促進(jìn)乳蛋白的合成。Mahmood等[50]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)向培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中添加一定濃度的賴氨酸和蛋氨酸后，可以激活mTOR信號(hào)通路的表達(dá)[51]。除氨基酸以外，小肽也可以通過(guò)mTOR信號(hào)通路調(diào)控乳蛋白的合成。Yang等[52]將蛋氨酸替換成蛋氨酸-蛋氨酸二肽添加到奶牛乳腺組織中，發(fā)現(xiàn)mTOR通路上的關(guān)鍵基因表達(dá)顯著增加，從而促進(jìn)乳蛋白的合成。Menzies等[53]的試驗(yàn)結(jié)果表明，胰島素作用于mTOR信號(hào)通路后，通過(guò)4EBP1加快了調(diào)節(jié)翻譯的速度，進(jìn)而協(xié)調(diào)乳蛋白合成速度。Hayashi等[54]將生長(zhǎng)激素注射到奶牛乳腺組織中，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素可以通過(guò)mTOR途徑改變酪蛋白mRNA的起始和翻譯，顯著增加牛奶的產(chǎn)量。

1.3 GCN2-eIF2a信號(hào)通路

蛋白質(zhì)合成的過(guò)程中其所需氨基酸不可替代，并必不可少，因此動(dòng)物體內(nèi)必須要有一個(gè)監(jiān)管機(jī)制，有效地監(jiān)督是否缺乏某種氨基酸[55]，以避免合成肽鏈過(guò)程中的失敗[56]。在一般性調(diào)控中，阻遏蛋白激酶2（GCN2）發(fā)揮著重要的作用，它對(duì)空載tRNA具有極高的結(jié)合性[57]，能有效感知各種氨基酸的缺乏和不足[58]。當(dāng)氨基酸的含量充足時(shí)，氨基酸與特定的tRNA相連接，當(dāng)氨基酸含量不足時(shí)，則GCN2易與空載tRNA相結(jié)合從而被激活[59]。

活化后的GCN2可以磷酸化真核翻譯起始抑制因子eIF2a[60]，通過(guò)eIF2a磷酸化引起的翻譯起始阻礙來(lái)抑制全局蛋白翻譯的速率[61]，從而降低細(xì)胞內(nèi)氨基酸的消耗量。GCN2還會(huì)激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），其是機(jī)體中控制適應(yīng)性功能的相關(guān)基因的重要調(diào)控子，通過(guò)增強(qiáng)某些特定基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)促進(jìn)多巴胺的釋放、抑制采食氨基酸失衡飼料[62]，進(jìn)而緩解氨基酸缺乏的危害。Timosenko等[63]發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)均衡的培養(yǎng)基細(xì)胞中幾乎無(wú)ATF4，然而當(dāng)色氨酸或谷氨酰胺缺乏時(shí)，ATF4的表達(dá)顯著增加，且氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)也增加，此時(shí)再把細(xì)胞的ATF4敲除后，也不會(huì)影響氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的變化。當(dāng)敲除腸上皮細(xì)胞中的GCN2基因，則會(huì)降低氨基酸缺乏時(shí)的自噬反應(yīng)[64]。缺乏氨基酸會(huì)導(dǎo)致GCN2的激活進(jìn)而引起自噬基因的轉(zhuǎn)錄，機(jī)體內(nèi)部通過(guò)自噬反應(yīng)循環(huán)利用體內(nèi)的氨基酸，以彌補(bǔ)氨基酸總量上的不足。

2 展望

提高乳產(chǎn)量和乳質(zhì)量是奶牛行業(yè)一直追求的目標(biāo)，但僅靠簡(jiǎn)單地引進(jìn)高產(chǎn)品種，提升日糧蛋白質(zhì)水平已不能滿足要求。隨著細(xì)胞分子學(xué)的發(fā)展，乳蛋白合成信號(hào)通路已經(jīng)成為當(dāng)前泌乳生物學(xué)研究的重點(diǎn)。在乳腺中蛋白質(zhì)的合成極其復(fù)雜，不同環(huán)境、不同生理狀態(tài)下，JAK-STAT、mTOR和GCN2-eIF2a等信號(hào)通路在乳蛋白合成過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。全面了解奶牛乳腺蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路分子的機(jī)理，有助于對(duì)奶牛乳腺中乳蛋白的合成進(jìn)行分析，可為合理調(diào)控營(yíng)養(yǎng)供給、為提高家畜的生產(chǎn)效率提供一定的依據(jù)。本文對(duì)與乳蛋白合成相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行了綜述，希望能為后續(xù)的相關(guān)研究有一些參考作用，對(duì)奶牛的生產(chǎn)產(chǎn)生一定的影響。