硝基化合物作為反芻動物潛在產(chǎn)甲烷抑制劑的研究進展

郝增華，劉旭日*，張海靜，連一葦

（1.邯鄲職業(yè)技術(shù)學院，河北邯鄲 056001；2.河北工程大學，河北邯鄲 056038）

甲烷是排在二氧化碳之后的第二大溫室氣體，對全球變暖潛力比二氧化碳高25 倍以上。在畜牧業(yè)領(lǐng)域，反芻動物被認為是造成甲烷排放的主要原因。甲烷也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的一個重要標志，因為它在反芻動物體內(nèi)的產(chǎn)量約占飼料能量的2% ～15%，甲烷排放在一定程度上抑制了飼料向畜產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化，減少甲烷的排放旨在增加畜產(chǎn)品的產(chǎn)量。因此，減少反芻動物甲烷排放不僅有利于環(huán)境保護，而且有利于反芻動物的長期可持續(xù)發(fā)展。通過改變?nèi)占Z來降低瘤胃甲烷的產(chǎn)生，如增加淀粉含量來優(yōu)化日糧配方、飼料轉(zhuǎn)化率高的遺傳選擇、飼料添加劑應(yīng)用等。在這些研究中，許多飼料添加劑已被應(yīng)用于反芻動物，以減少甲烷的排放，如莫能菌素，聚醚類離子載體型，已被應(yīng)用于反芻動物的飼養(yǎng)實踐，但它要么對寄主動物有毒，要么僅有短暫的抑制作用。在過去的幾十年里，人們發(fā)現(xiàn)，硝基化合物包括硝基乙烷、2- 硝基醇、2- 硝基-1- 丙醇、3- 硝基-1- 丙醇、3- 硝基-1- 丙酸，抑制體外瘤胃甲烷的產(chǎn)生高達90%（Zhang 和Yang，2012）、體內(nèi)抑制超過69%（Brown 等，2011）。這些硝基化合物主要指短鏈的一元脂肪族硝基化合物，許多瘤胃微生物能耐受這些硝基化合物中相對高濃度的硝基毒素。迄今為止，人們主要認為，硝基化合物在瘤胃甲烷生產(chǎn)中的抑制作用是替代電子受體，它們競爭性的降低還原物，對氫氣和甲酸鹽氧化產(chǎn)生抑制作用。本文綜述了硝基化合物抑制甲烷產(chǎn)生的潛在作用，在生產(chǎn)實踐中，硝基化合物對瘤胃甲烷生成的抑制作用高達69%。同時探討了硝基化合物抑制瘤胃甲烷生成的可能機制和代謝過程。

1 硝基化合物及其在甲烷生產(chǎn)中的抑制作用

硝基化合物的分子公式為R-NO2，可視為碳氫化合物、醇類和脂肪酸的衍生物，其中硝基化合物中R 基團可以是烷基、羥基等，可分離一個或多個氫原子。根據(jù)不同烷基的存在，硝基化合物可分為脂肪族硝基化合物和芳香族硝基化合物；根據(jù)硝基的數(shù)目也被分為一元、二元和多元硝基化合物。但硝基化合物對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)甲烷抑制作用的研究主要集中在短鏈一元脂肪族硝基化合物。

1.1 硝基乙烷 硝基乙烷（分子式：C2H5NO2）是一種無色油性液體，具有難聞的氣味和刺激性，幾乎不溶于水。據(jù)作者所知，脂肪族硝基乙烷沒有生物來源，一般都是人工合成。近年來，對硝基乙烷對產(chǎn)甲烷的抑制作用廣受關(guān)注，刺激了反芻動物甲烷排放研究。Brown 等（2011）證實了硝基乙烷對處理過的奶牛瘤胃微生物的抑制甲烷作用。硝基乙烷通過口服或瘺管直接給藥的方式進入瘤胃已被證明可減少高達69% 的甲烷排放。但硝基乙烷在瘤胃中的抗甲烷作用機制尚不明確，有必要進行進一步研究，更全面地闡明其毒性、抑制活性和作用方式。

1.2 3- 硝 基-1- 丙 醇 3- 硝 基-1- 丙 醇（分子式：C3H7NO3）作為一種硝基氧化物，其在瘤胃甲烷減排中的作用被廣泛研究。Martinez-Fernandez 等（2014）發(fā)現(xiàn)，100 mg/d 3- 硝基-1-丙醇可以使泌乳奶牛的甲烷產(chǎn)量降低16%。此外，Hristov 等（2015）發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加40 ～80 mg/kg 3- 硝基-1- 丙醇可以使高產(chǎn)奶牛甲烷排放降低30%，而對奶牛的生產(chǎn)性能無負面影響。目前，3- 硝基-1- 丙醇是一種有效的甲烷抑制劑，專門針對甲基還原酶，可有效抑制甲烷生成（Hristov 等，2015）。

1.3 其他硝基化合物 一般來說，像2- 硝基乙醇（分 子 式：C2H5NO3）、2- 硝 基-1- 丙 醇（分 子式：C3H7NO3）這樣的硝基醇和3- 硝基-1- 丙酸（分子式：C3H5NO4）這樣的硝基酸都是短鏈脂肪族硝基化合物。Anderson 等（2006）發(fā)現(xiàn)，每日口服120 mg/kg2- 硝基-1- 丙醇可以使甲烷產(chǎn)量降低37%。2- 硝基醇是一種低沸點的淡黃色液體、脂肪族硝基醇，具有直鏈碳架，包含一個硝基和醇官能團。目前關(guān)于2- 硝基醇的體內(nèi)動物試驗未見報道，但其作用效果與硝基乙烷類似（Anderson等，2006）。

2 硝基化合物抑制甲烷生成的作用模式

反芻動物的產(chǎn)甲烷活性釋放了產(chǎn)甲烷菌生存所需的能量，維持了較低的氫氣壓力，為瘤胃發(fā)酵創(chuàng)造良好環(huán)境。但大多數(shù)傳統(tǒng)的抗甲烷策略都抑制了氫氣的有益氧化，導致氫氣積累。此外，一些產(chǎn)甲烷抑制劑也有副作用，降低了某些消化過程和微生物代謝物的產(chǎn)量，同時降低了乙酸產(chǎn)量，增加了可發(fā)酵酸含量，尤其是丙酸。由于瘤胃生態(tài)系統(tǒng)具有適應(yīng)紊亂的能力，一些產(chǎn)甲烷抑制劑的作用往往是暫時的。但硝基化合物作為甲烷抑制劑時，在瘤胃或體外培養(yǎng)中對揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量及飼料利用效率的影響較小（Anderson等，2006）。研究發(fā)現(xiàn)，硝基化合物對甲烷生成的抑制并沒有顯著增加氫氣的積累。迄今為止，人們普遍認為硝基化合物可能通過抑制氫氣和甲酸鹽氧化來抑制甲烷的生成，作為電子的替代受體，競爭性地消耗還原當量（其中產(chǎn)甲烷階段：甲烷菌利用CO2、H2產(chǎn)生CH4，產(chǎn)甲烷反應(yīng)：HCOOH+H2O → CH4+HCO3-4H2+HCO3-+H+→ CH4+3H2O）。因此，硝基化合物被認為具有抗甲烷的潛力，并最終可能促進開發(fā)商業(yè)上可行的干預(yù)措施，以減少瘤胃甲烷的生成。

（1）瘤胃甲烷抑制與揮發(fā)性脂肪酸生成的關(guān)系，甲烷抑制劑會導致丙酸鹽代償性增加，同時乙酸鹽累積量減少，導致?lián)]發(fā)性脂肪酸總量下降。但與其他甲烷抑制作用方式不同的是，硝基化合物對瘤胃微生物菌群產(chǎn)生的摩爾比例影響不大（Anderson 等，2006），其研究表明，硝基乙烷不會引起瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度的顯著變化（乙酸、丁酸和揮發(fā)性脂肪酸總量）。另一種可能是，微生物種群與甲烷生成過程中保留下來電子結(jié)合將硝基化合物還原為各自的胺。由于細菌代謝率隨發(fā)酵時間的增加而增加，表明硝基代謝的微生物發(fā)生了富集（Gutierrez-Banuelos 等，2008），這可能為瘤胃功能作出積極作用，因為這些微生物種群可以用于減少硝基一部分電子的消耗。

（2）氫積累瘤胃中氫的濃度大約是1μM，氫氣在瘤胃中的積累傳統(tǒng)上是不可取的，因為它抑制還原核苷酸的再氧化，降低微生物細胞產(chǎn)量和發(fā)酵效率（Miller，1995）。甲烷殘留降低能維持瘤胃微生物種群在瘤胃發(fā)酵過程中積累還原性物質(zhì)的能力。硝基乙烷被認為是瘤胃細菌的末端電子受體，因此，有可能消耗掉以甲烷生產(chǎn)為代價的還原物質(zhì)。與大多數(shù)瘤胃甲烷生成抑制劑不同，硝基化合物對甲烷生成的抑制并沒有顯著增加瘤胃微生物對氫氣的積累。Anderson 等（2003）研究表明，與對照組相比，硝基化合物組至少降低57% ～94% 的甲烷生產(chǎn)量，表明微生物種間的氫轉(zhuǎn)移，即減少在發(fā)酵過程中等量的消耗（Miller，1995）。在這些含氮培養(yǎng)基中，氫氣積累量低與甲酸脫氫酶/ 甲酸氫裂解酶活性可能抑制氫氣產(chǎn)生是一致的，因為在沒有甲烷產(chǎn)生的情況下，氫氣可能會積累到更高的濃度（Anderson 等，2003）。此外，有可能是由于氫氣濃度超過抑制氫化酶催化生成氫氣的濃度，從而阻止了含氮培養(yǎng)基中氫氣的積累（Miller，1995），而氫化酶也是可逆酶，可以催化氫氣的生成或氧化，也可能是硝基化合物抑制了氫氣生成氫酶的活性。

（3）甲酸鹽氧化的抑制和鐵氧化還原蛋白相關(guān)氫化酶活力，一些瘤胃產(chǎn)甲烷菌通過甲酸脫氫酶的微生物活性直接氧化甲酸鹽，據(jù)估計，瘤胃中甲烷產(chǎn)生的18% 都是來自甲酸鹽，Anderson 等（2008）指出，甲烷產(chǎn)量減少97%，甲酸濃度維持在118%。此外，2- 硝基醇通過鐵氧化還原蛋白抑制克氏梭菌鐵氧化還原蛋白相關(guān)氫化酶活性，但目前還不清楚2- 硝基醇或其他硝基化合物是否同樣抑制不利用鐵氧化還原蛋白作為電子載體的產(chǎn)甲烷菌的電子載體連接活性（Deppenmeier，2002）。

（4）McAllister 等（1996）報道了瘤胃生態(tài)系統(tǒng)對各種甲烷抑制化合物的適應(yīng)性。在此類研究中，硝基乙烷處理后第5 天，微生物產(chǎn)甲烷活性減少，表明硝基化合物對瘤胃微生物群具有潛在的適應(yīng)性。瘤胃對這些硝基化合物的適應(yīng)可能是由于體內(nèi)硝基化合物還原細菌的富集，這種細菌能消耗抑制劑的有效濃度。硝基化合物還原菌數(shù)量的增加可以加速瘤胃中硝基化合物及其相關(guān)抗甲烷活性。如Anderson 等（2006）發(fā)現(xiàn)，硝基化合物的抗甲烷作用（特別是在低劑量時）似乎是短暫的，Brown 等（2011）研究表明，沒有證據(jù)可以表明瘤胃微生物種群對硝基乙烷有適應(yīng)性反應(yīng)，因為與第1 天相比，試驗第4 天和第8 天的甲烷排放量都減少約15%。因此，后續(xù)研究需要在不同類型日糧條件下充分評估瘤胃微生物種群的潛力，以適應(yīng)硝基化合物的處理。

一般來說，似乎沒有任何障礙可以限制使用硝基化合物作為甲烷生成抑制劑，因為揮發(fā)性脂肪酸的生成和發(fā)酵效率沒有受到影響，同時體內(nèi)研究也沒有發(fā)現(xiàn)氫氣的積累。此外，輔酶M 甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基輔酶M- 還原酶分別是產(chǎn)甲烷過程中負責甲基基團轉(zhuǎn)移和氫- 電子轉(zhuǎn)移的兩個關(guān)鍵酶。但目前還不清楚硝基化合物在抑制瘤胃甲烷生成過程中如何影響這些輔酶的活性。

3 瘤胃中硝基化合物毒性及微生物對硝基化合物的代謝

3.1 硝基化合物毒性 硝基化合物抑制甲烷生成的作用對環(huán)境具有重要意義。盡管只有10% ～20% 的微生物種群暴露于硝基化合物中，可能受到瘤胃中給定濃度的抑制，但大多數(shù)瘤胃微生物已能耐受相對高濃度的硝基毒素（Anderson 等，1993）。在反芻動物上連續(xù)16 d 給予160 mg/kg 體重的硝基乙烷沒有發(fā)現(xiàn)顯著的毒性跡象。但James 等（1980）發(fā)現(xiàn)，靜脈注射30或52 mg/kg 3- 硝基丙醇達到了牛和羊的致死劑量。因反芻動物對高濃度硝基毒素具有耐受性，使硝基化合物作為抗甲烷抑制劑在實際應(yīng)用中成為可能。

3.2 瘤胃微生物對硝基化合物的代謝 反芻動物瘤胃內(nèi)的多種微生物可以消除由硝基化合物產(chǎn)生的毒性，包括瘤胃擬桿菌屬、脫硫弧菌屬、瘤胃硒單胞菌、及梭菌、糞球菌、乳酸菌和消化性鏈球菌，這些微生物可能主要是減少硝基甲烷、3-硝基丙醇、氨基乙烷、氨基乙醇的毒性（Anderson等，1993）。到目前為止，只有一種名為D. 脫毒劑的代謝細菌（革蘭氏陽性，特異性呼吸厭氧菌，能代謝硝基化合物）可以在反芻動物逐漸適應(yīng)硝基毒素的耐受性過程中起重要作用（Anderson 等，2006）。

瘤胃氮化合物代謝速率受多種因素的影響。補充含有硝酸鹽或硝基乙烷的低毒性類似物硝基丙醇可提高瘤胃硝基丙醇代謝率（Majak，1992），研究發(fā)現(xiàn)，當放牧牛群采食糖蜜時硝基丙醇代謝率增加24%。同時大量還原劑和發(fā)酵產(chǎn)物的供應(yīng)（包括氫、甲酸鹽、乳酸鹽及其他幾種底物）將導致瘤胃硝酸鹽和亞硝酸鹽的快速還原，這意味著不同日糧對3- 硝基丙醇代謝的影響同樣表現(xiàn)為提供大量所需的還原物質(zhì)。但在某些情況下，瘤胃內(nèi)的硝基毒素代謝可能受到其他必要底物或營養(yǎng)物質(zhì)有效性的限制，這還需要進一步研究。

4 結(jié)論

甲烷的排放主要來自反芻動物，是全球變暖的一個重要因素。減少反芻動物的甲烷排放迫在眉睫。本文綜述了近年來硝基化合物作為瘤胃產(chǎn)甲烷有效抑制劑的研究進展，硝基化合物對瘤胃發(fā)酵的抑制作用較好，對瘤胃發(fā)酵的危害較小。但瘤胃生成甲烷涉及許多生物學過程，這些過程有許多酶和輔酶參與。但目前還不清楚硝基化合物影響甲基和氫- 電子轉(zhuǎn)移酶活性的作用機理，需要進一步探討硝基化合物的抑制作用模式。