抗氧化劑防治老年性聾的研究進展

歐陽朝明 董楊

(上海中醫(yī)藥大學 1教學實驗中心，上海 201203;2基礎(chǔ)醫(yī)學院)

衰老是一種普遍的生理現(xiàn)象，以生物體時間依賴的功能衰退為特征〔1〕。此過程常伴隨著與年齡相關(guān)的聽力損失，也稱老年性聾。老年性聾是老年人中最常見的感覺障礙，調(diào)查顯示，在65歲以上的人群中，老年性聾的發(fā)病率為25%～40%，大于75歲的老年人中，其發(fā)病率為48%～66%，而85歲以上的老年人發(fā)病率則超過80%〔2〕。老年性聾還會導致社交孤獨、抑郁和認知能力障礙等疾病。據(jù)2016年的全球疾病負擔(GBD)報告顯示，聽力喪失已成為致殘年數(shù)(YLDs)的第三大原因，也是全球健康的一個重要問題，特別是在老年人口中〔3〕。

1 老年性聾的氧化應(yīng)激發(fā)病機制

到目前為止，老年性聾的發(fā)病機制尚不十分清楚。氧化應(yīng)激造成的損傷是目前比較公認的老年性聾發(fā)病機制之一。生理狀態(tài)下，活性氧(ROS)作為細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞周期調(diào)節(jié)的氧化還原反應(yīng)信使發(fā)揮功能，可以被內(nèi)源性的抗氧化機制代謝和清除。氧化應(yīng)激是指ROS生成和生物體抗氧化損傷能力的失衡。耳蝸中的ROS主要來源于線粒體，線粒體DNA(mtDNA)對于ROS造成的損傷尤為敏感，一個原因是mtDNA位置與ROS產(chǎn)生的位置相近，另一個原因是，與核DNA相比，mtDNA損傷修復的能力更為有限〔4〕。Falah等〔5〕對老年性聾患者的mtDNA控制區(qū)4種核苷酸變異頻率進行研究，共有58例老年性聾患者和220例對照者參加了這項研究，采用聚合酶鏈反應(yīng)和Sanger測序法研究mtDNA控制區(qū)的遺傳變異，研究結(jié)果顯示，老年性聾患者mtDNA控制區(qū)的4種核苷酸變異頻率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，進一步支持了線粒體在老年性聾發(fā)展過程中細胞內(nèi)機制中具有重要作用，這些變異有可能成為老年性聾發(fā)生高風險的診斷標記。Du等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，在注射D-半乳糖8 w的擬老化SD大鼠模型中，耳蝸mtDNA普遍缺失和線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷增加，耳蝸中NADPH氧化酶(NOX)3、8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)、NADP氧化酶亞單位(P22phox)、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase)3表達及脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)陽性細胞數(shù)均高于對照組，表明一氧化氮合酶NOX3介導的氧化應(yīng)激促進了mtDNA突變的聚集，激活Caspase3依賴性細胞凋亡信號通路促進耳蝸老化過程細胞死亡。除了外周改變外，有研究者對聽覺中樞聽皮層進行研究發(fā)現(xiàn)，伴隨年齡增長的核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)信號通路活性降低及相關(guān)的mtDNA損傷，是老年性聾聽皮層老化的主要機制之一〔7〕。正常情況下，線粒體產(chǎn)生的ROS易為內(nèi)源性抗氧化劑代謝清除，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)或其他相關(guān)的酶，以維持內(nèi)耳的動態(tài)平衡，而衰老過程打破了這種穩(wěn)態(tài)。近期，有研究報道從細胞水平和整體水平研究ROS介導的DNA損傷應(yīng)答是否推動了耳蝸毛細胞的老化，結(jié)果顯示，過氧化氫(H2O2)暴露可以使耳蝸毛細胞磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)和P53結(jié)合蛋白(53BP1)的表達增加，啟動 DNA損傷應(yīng)答，而合成的SOD/CAT模擬物含錳氧化應(yīng)激抑制物(EUK-207)在體外可減輕H2O2誘導的耳蝸細胞DNA損傷和衰老表型，在體內(nèi)可減緩快速老化小鼠模型(SAMP8)小鼠年齡相關(guān)的聽力損失和耳蝸毛細胞退化，綜上得出結(jié)論，ROS誘導的DNA損傷應(yīng)答推動了耳蝸毛細胞的衰老，可以加快老年性聾的發(fā)生發(fā)展〔8〕。

2 抗氧化劑與老年性聾

在老年性聾中，毛細胞或螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元一旦損失，會導致聽閾升高，不能再恢復到正常水平，因為這兩類細胞在哺乳動物中都是不可再生的。因此，預防和延緩是老年性聾的重要干預手段。抗氧化劑是目前防治老年性聾研究較多的一類藥物，主要通過降低氧化應(yīng)激造成的損傷來延緩老年性聾的發(fā)生〔9，10〕?？寡趸瘎┓譃橹苯涌寡趸瘎┖烷g接抗氧化劑，直接抗氧化劑比如輔酶(Co)Q10和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，可以直接跟ROS反應(yīng)降低氧化應(yīng)激；間接抗氧化劑，比如酚類化合物和營養(yǎng)物質(zhì)，可以激活細胞氧化還原酶〔11〕。

2.1直接抗氧化劑 NAC具有很強的清除ROS的能力，還能上調(diào)還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶(GXH-Px)，并通過防止脂質(zhì)過氧化而抑制ROS的產(chǎn)生。在Ding等〔12〕的研究中，采用Ggt1基因核苷酸缺失突變(Ggt1dwg/dwg)轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠體現(xiàn)為γ谷?；D(zhuǎn)移酶1基因功能突變，而這個基因主要編碼一種對于GSH合成有重要作用的抗氧化酶。結(jié)果顯示，用Ggt1dwg/dwg轉(zhuǎn)基因小鼠體現(xiàn)了年齡相關(guān)的聽力損失和病理改變，是老年性聾的理想模型，NAC能減輕Ggt1dwg/dwg轉(zhuǎn)基因小鼠的年齡相關(guān)性聽力損失和內(nèi)毛細胞損失，認為NAC具有延緩老年性聾的作用。還有研究在SAMP8老化小鼠上觀察到，NAC可以延緩伴隨老化的聽力損失，對耳蝸毛細胞有保護作用〔13〕。Tan等〔14〕采用線粒體蛋白抑癌基因(FUS1)的基因敲除(FUS1 KO)小鼠，作為代謝型老年性聾小鼠模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)嚴重聽力喪失之前，3月齡FUS1 KO小鼠耳蝸的抗氧化、營養(yǎng)物質(zhì)和能量感知通路就已經(jīng)發(fā)生病理改變，4～5月齡的FUS1 KO小鼠即出現(xiàn)耳蝸內(nèi)電位(EP)的下降，認為可能是由于小鼠耳蝸血管紋中嚴重的線粒體和血管病變所致。短期給予抗氧化劑NAC治療可以糾正這些病理分子變化，而長期給予NAC可以恢復EP，改善聽性腦干反應(yīng)(ABR)聽閾值，修復線粒體結(jié)構(gòu)，進而延緩老年性聾小鼠的聽力損失。

維生素C是一種重要的親水性抗氧化劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑，與老年性聾的發(fā)生有密切關(guān)系。Kang等〔15〕基于韓國國民健康與營養(yǎng)調(diào)查的數(shù)據(jù)，通過對1 910位參與者的數(shù)據(jù)進行單變量和多元線性回歸分析得出結(jié)論，飲食中攝入維生素C與老年人聽力改善顯著相關(guān)，而只有不到一半的老年人獲取了足量的維生素，隨著年齡增加，維生素攝入會減少，因此認為補充合適的維生素有利于抑制老年人的聽力下降。老年性聾是多種原因造成的復雜疾病，單一干預手段可能不能達到良好的治療效果，兩種或以上治療手段聯(lián)合，比如抗氧化劑與耳蝸血管擴張劑聯(lián)合使用有可能達到更好的治療效果〔16〕。Alvarado等〔17〕給3月齡Wistar大鼠服用自由基清除劑維生素A、C、E和耳蝸血管擴張藥鎂離子(Mg2+)的聯(lián)合制劑，在6～8月齡和12～14月齡進行聽功能檢測，結(jié)果顯示，給藥組聽閾值明顯低于對照組，表明該聯(lián)合制劑可以延緩年齡相關(guān)的聽功能損傷，對老年性聾有輔助的治療作用。CoQ10是一種存在于自然界的脂溶性醌類化合物，其結(jié)構(gòu)與維生素K、維生素E相似，是作用較強的脂溶性抗氧化劑。有臨床試驗觀察到，口服水溶性CoQ10可以改善老年性聾患者的聽力損失〔18〕。Someya等〔19〕的研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠口服CoQ10和α-硫辛酸均可以抑制耳蝸Bak基因表達，降低耳蝸細胞損傷，延緩老年性聾。α-硫辛酸是一種兼具水溶性和脂溶性的抗氧化劑，是一種類似維生素的物質(zhì)。Ahn等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，α-硫辛酸可以抑制近交系(DBA)小鼠早發(fā)性的聽力損失。

動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，口服六種抗氧化劑L-半胱氨酸-谷胱甘肽(L-CySSG)、核糖半胱氨酸、NW-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)、維生素B12、葉酸和維生素C的混合溶液，可以明顯改善C57BL/6小鼠年齡相關(guān)的聽力損失。其中，L-CySSG是L-半胱氨酸和GSH的混合物，抗ROS非常有效；而核糖半胱氨酸是半胱氨酸前體藥物，半胱氨酸又是GSH生物合成中的關(guān)鍵成分；LNAME是NOS抑制劑，因此它能減慢或阻止耳蝸內(nèi)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生及其隨后的損害作用；維生素B12和葉酸在DNA合成和修復中至關(guān)重要〔21〕。

2.2間接抗氧化劑 Sanz-Fernandez等〔22〕選用了6種多酚類化合物單寧酸、白藜蘆醇、槲皮素，蕓香苷，沒食子酸和桑色素混合在一起，觀察其對大鼠年齡相關(guān)聽力損失的作用，發(fā)現(xiàn)該多酚類混合物可以明顯改善大鼠多頻穩(wěn)態(tài)聽覺誘發(fā)反應(yīng)(ASSR)和ABR的聽閾值，有延緩老年性聾的作用。Sánchez-Rodríguez等〔23〕的研究也發(fā)現(xiàn)，該多酚混合物可以減低老年大鼠升高的ROS水平，改善老年大鼠的SOD與GSH-Px的活性，顯著改善ASSR閾值。該多酚混合物還可以降低老年大鼠耳蝸DNA氧化損傷標志物8-OHdG水平和三磷酸腺苷(ATP)水平，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3/9的表達，認為多酚可以降低老年大鼠耳蝸的氧化應(yīng)激水平，抑制細胞凋亡，從而達到延緩老年性聾的作用〔24〕。

3 具有抗氧化作用的中藥與老年性聾

中藥中有許多具有抗氧化作用的成分，是巨大的天然抗氧化劑寶庫。Tanigawa等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)，大豆中的大豆β-伴球蛋白(β-Conglycinin)可以提高耳蝸血流，提高血管紋中的內(nèi)源一氧化氮合酶的表達，緩解氧化損傷，降低血管紋中邊緣細胞的脂褐素顆粒和微血管周細胞空泡變性；β-伴球蛋白還能減輕耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞損失，降低脂褐素顆粒、核內(nèi)侵、髓鞘空泡化的頻率。綜上，認為β-伴球蛋白主要通過維持耳蝸血管血流和抑制氧化應(yīng)激來改善老年性聾。銀杏葉提取物EGb761作為一種ROS清除劑，它能防止脂質(zhì)過氧化、提高GSH含量及GSH還原酶的活性。Nevado等〔26〕的研究顯示，EGb761可以改善12月齡SD大鼠的ASSR，下調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-7的表達。Liu等〔27〕研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮提取物能通過調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶1核靶向亞單位/蛋白磷酸酶1(PNUTS/PP1)信號通路降低氧化應(yīng)激對耳蝸的損傷，從而減緩了D-半乳糖誘導的老年性聽力損失，具有防治老年性聾的作用。白藜蘆醇是一種多酚二苯乙烯類物質(zhì)，存在于葡萄、桑樹、花生、朝鮮槐等多種植物中，在中藥土茯苓、虎杖、何首烏、三七、厚樸中也有一定含量，有研究表明，白藜蘆醇能顯著地抑制miR-34a過表達及H2O2氧化損傷導致的耳蝸毛細胞株HEI-OC1死亡，用之喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠兩個月后，顯著降低了小鼠的聽閾值和耳蝸毛細胞的丟失〔28〕。Du等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)，羅布麻寧可以抑制D-半乳糖導致衰老模型大鼠蝸腹側(cè)核的NOX活性、H2O2水平、mtDNA共同缺失和8-OHdG表達，并提高總SOD(T-SOD)和GSH-Px的活性；羅布麻寧還可以減輕D-半乳糖的衰老模型大鼠蝸腹側(cè)核線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷，促進ATP產(chǎn)生，提高線粒體膜電位水平，抑制細胞色素C從線粒體進入細胞質(zhì)及Caspase 3依賴的細胞凋亡。

綜上所述，由于毛細胞不具有再生能力，預防和延緩老年性聾是主要策略。研究者在老年性聾的動物模型上觀察到許多抗氧化劑體現(xiàn)了延緩年齡相關(guān)性聽力損失的作用，是潛在的抗老年性聾藥物，但大多缺乏進一步的藥學相關(guān)研究，臨床研究也較少，離臨床應(yīng)用尚有很長的距離。由于氧化應(yīng)激無疑是老年性聾等衰老相關(guān)疾病的重要發(fā)病機制之一，因此抗氧化劑仍然是目前防治老年性聾一類潛在藥物，值得深入探討和研究。更值得注意的是，抗氧化劑除了常見的化合物外，中藥也是一個巨大的資源寶庫，其種類繁多，尚有許多我們不清楚的抗氧化成分。因此，應(yīng)借助中藥基礎(chǔ)理論的指導，以中藥現(xiàn)代化研究手段的進步為依托，努力探索發(fā)掘提取其中的有效成分。另外，還可對現(xiàn)有抗氧化劑進行結(jié)構(gòu)修飾等提高藥效，也是研究抗氧化劑防治老年性聾的重要思路。