石油降解菌的篩選、鑒定及降解石油研究

劉永江 解蕾 劉書(shū)慧（青島大港海關(guān)，山東 青島

266011）

石油產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活各方面，包括工農(nóng)業(yè)，交通運(yùn)輸業(yè)等各行業(yè)，石油被稱(chēng)為黑色的金子，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，石油產(chǎn)量不斷提高，世界產(chǎn)油國(guó)家地區(qū)有150多個(gè)，年產(chǎn)石油總量超30億噸。隨著石油工業(yè)發(fā)展，大量含石油物質(zhì)廢水排入土壤，石油帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題日益突出，對(duì)石油污染土壤修復(fù)治理，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。污染土壤治理中，微生物修復(fù)由于具有費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)受到人們重視，為污染土壤修復(fù)帶來(lái)技術(shù)革命。

1 已有研究綜述

通常所稱(chēng)石油是從地下開(kāi)采未提煉的原油，經(jīng)提煉加工可制成多種燃料，包括天然氣，煤油等。石油顏色多為黑色，少數(shù)為暗綠色。常溫下呈流體狀態(tài)，粘度范圍寬，沸點(diǎn)范圍為常溫到500℃以上，石油物理性質(zhì)差異原因是化學(xué)組成不同。石油化學(xué)組分復(fù)雜，隨產(chǎn)地不同有差異。碳?xì)湓貫闊N類(lèi)化合物存在，石油中含有幾十種微量元素。石油主要由烷烴等烴類(lèi)化合物組成，烴類(lèi)化合物相對(duì)分子質(zhì)量范圍很大，石油烴以固液氣三態(tài)存在于石油中。烷烴是組成石油的主要成分，石油非烴組分有6種[1]。

石油污染土壤對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重危害，荷蘭在80年代花費(fèi)15 億美元進(jìn)行土壤修復(fù)工作，美國(guó)在2005 年用于石油烴污染場(chǎng)地修復(fù)資金棕色土地基金達(dá)2200萬(wàn)美元。石油污染土壤處理方法可分為理化處理與生物處理。80年代前，污染土壤治理僅限于理化處理，化學(xué)處理主要有土壤洗滌法等，物理處理包括隔離法等，理化處理法能快速凈化土壤中石油污染，但其固有缺陷限制了應(yīng)用范圍，物理方法去除污染物時(shí)破壞土壤結(jié)構(gòu)，化學(xué)方法試劑造成土壤二次污染。生物修復(fù)是利用生物生命代謝減少土壤有毒物質(zhì)濃度，使污染土壤環(huán)境恢復(fù)到原始狀態(tài)，生物修復(fù)類(lèi)型可分為微生物修復(fù)，動(dòng)植物修復(fù)。生物修復(fù)具有費(fèi)用低，對(duì)環(huán)境影響小等有點(diǎn)，美國(guó)EPA 修訂法案將生物修復(fù)定為原有污染土壤修復(fù)首選措施，我國(guó)環(huán)保局提出重點(diǎn)研究微生物處理技術(shù)[2]。

國(guó)外開(kāi)展微生物質(zhì)量石油污染研究較早，發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)展較為成熟，歐美土壤生物修復(fù)技術(shù)已得到應(yīng)用。我國(guó)自70年代開(kāi)始有學(xué)者關(guān)注相關(guān)研究，但實(shí)際研究較少，90年代發(fā)展快速，綜合運(yùn)用微生物學(xué)，生態(tài)學(xué)等方法，開(kāi)展生物毒理學(xué)，生物工程技術(shù)研究。研究主要集中于降解石油微生物研究，石油理化特性對(duì)微生物降解作用的影響，環(huán)境因素對(duì)微生物降解作用的影響。目前對(duì)石油污染微生物修復(fù)技術(shù)研究取得了很多的進(jìn)展，但仍存在一些問(wèn)題，如修復(fù)技術(shù)工藝有待完善，復(fù)合菌群協(xié)同作用降解機(jī)制不清楚。本文研究勝利油田石油土壤修復(fù)技術(shù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選復(fù)合菌群，利用氣相色譜法對(duì)復(fù)合菌群降解后殘余石油組分分析。獲得針對(duì)油田地區(qū)石油污染土壤修復(fù)的微生物菌群資源，對(duì)菌群菌株增殖培養(yǎng)進(jìn)程初步研究，利用氣相色譜對(duì)組成菌株降解后石油組分分析，解釋復(fù)合菌群對(duì)石油烴降解率提高的原因。

2 石油降解篩選鑒定實(shí)驗(yàn)

3 種不同的土壤樣品均采自山東勝利油田，原油與市售0#柴油按1∶4的比例混合均勻。

富集培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.0g， MgSO4·7H2O 0.5g， Ca?Cl2 0.02 g，F(xiàn)eCl3 痕量，蒸餾水1 000 ml，121℃滅菌20 min，加入5 g石油。種子液培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

篩 選 培 養(yǎng) 基：NaNO3 1.5 g ，K2HPO4 1g KCl 0.5 g， Ca?Cl2 0.002 g，蒸餾水1 000 mL，加入2.5 g石油。加入1.2%的瓊脂制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

稱(chēng)取5g污染土壤加入富集培養(yǎng)基的三角瓶中，恒溫?fù)u床條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)富集培養(yǎng)25 d，經(jīng)梯度稀釋后涂布在固體PDA培養(yǎng)基上，待平板長(zhǎng)出菌落后，采用劃線分離法反復(fù)進(jìn)行分離純化，純化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面。

將菌株接種到降解用液體培養(yǎng)基的三角瓶中180 r·min-1的條件下培養(yǎng)5 d，稀釋后涂布在固體培養(yǎng)基上，觀察各菌株生長(zhǎng)情況，篩選出生長(zhǎng)較快的菌株。挑取單菌落接種到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基三角瓶中，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度。吸取5 ml 準(zhǔn)備好的種子液接種到篩選培養(yǎng)基三角瓶中，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4d后測(cè)定石油含量，計(jì)算平均降解率。

采用試劑盒提取并純化石油降解菌總DNA，對(duì)16S rDNA保守序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系如下：反向引物與正向引物各1 μl， ddH2O 補(bǔ)足至50 μl。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，50℃退火1 min，此步驟共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢驗(yàn)并進(jìn)行測(cè)序[3]。

通過(guò)BLAST 程序的序列進(jìn)行對(duì)比分析查找相似的核苷酸序列，利用軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的方法使用Neighbor-Joining法，進(jìn)化樹(shù)可靠性檢驗(yàn)選用自展檢驗(yàn)DNA 序列變異中的轉(zhuǎn)換賦于相同的加權(quán)值。

4 結(jié)語(yǔ)

從勝利油田采集的石油污染土樣，分離到50株細(xì)菌，將純化的細(xì)菌單菌落接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)。經(jīng)梯度稀釋后涂布在固體培養(yǎng)基上，結(jié)果初步篩選出生長(zhǎng)較好的33株細(xì)菌。

對(duì)菌株進(jìn)行石油降解能力的測(cè)定。石油降解率超過(guò)30%的細(xì)菌共16株。不同菌株對(duì)石油的降解能力不同，菌株P(guān)U-34的降解率達(dá)到58.38%，其余4 株菌分別為PU-15、PU-4。選取降解率高的菌株做鑒定。

對(duì)篩選出的石油降解率較高的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察。從PU-34、PU-2的16S rDNA 中擴(kuò)增得到基因片段，將PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序得到目的基因序列。與核酸序列進(jìn)行比較，找出同源性較高的序列進(jìn)行對(duì)比分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

PU-34 和黃單胞菌屬的11 個(gè)種的模式株序列同源性在96%～99%范圍內(nèi)，PU-34 與Pseudoxanthomonas mexicana 聚為一簇。PU-34為好氧的革蘭氏陰性桿菌，不能水解淀粉和尿素，不產(chǎn)生吲哚，結(jié)合生理生化特性確定PU-34屬于P.japonensis。

PU-15 與戈登氏菌屬很多種的模式株16S rDNA 序列同源性，挑選同源性較高的模式種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，PU-15 與食烷烴戈登氏菌的Gordonia alkalivorans DSM 44369T 位于同一分支PU-2與友好戈登氏菌的模式株位于同一分支。

國(guó)內(nèi)外很多研究結(jié)果報(bào)道從樣品中分離出假單胞菌屬、一些菌株具有較好的石油烴降解能力。假黃單胞菌屬是根據(jù)對(duì)Pseudoxanthomonas 的描述建立的，對(duì)分離自環(huán)境的嗜溫細(xì)菌進(jìn)行研究建立了新種。并對(duì)假黃單胞菌屬的描述進(jìn)行了修訂。國(guó)際權(quán)威雜志報(bào)道了4 株污染土壤中分離的假黃單胞菌屬細(xì)菌，包括臺(tái)灣高雄分離篩選到的生物活性劑的細(xì)菌，分離的P.spadix IMMIB AFH-5T，從加油站沉積物中分離的菌株P(guān).spadix BD-a59，以從污染土壤中分離的P.sacheonensis BD-c54T。石油降解菌經(jīng)鑒定為P.japonensis菌種，假黃單胞菌屬的某些菌株生物修復(fù)方面具有研究?jī)r(jià)值。