蝦肝腸胞蟲研究進展

郭琦，沈衛(wèi)鋒，樓寶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所， 浙江 杭州 310021)

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei, EHP)，屬于真菌界、微孢子蟲門(Microspora)、單倍期綱(Haplophasea)、壺孢目(Chytridiopsida)、腸胞蟲科(Enterocytozoonidae)、腸胞蟲屬(Enterocytozoon)[1-2]，是一種專性細胞內(nèi)寄生生物，其生活史一般包括感染期、增殖期和孢子繁殖期3個階段[3-4]。蝦肝腸胞蟲成熟孢子呈橢圓形，大小約為0.7 μm×1.1 μm，孢子具有一個細胞核，極絲5～6圈，一個后位空泡，一個錨狀物粘附在極絲上，和較厚的電子致密的孢子壁[1，5]。EHP的孢子壁由3部分組成，分別是一層細胞膜，一層較厚的電子密度低的孢子內(nèi)壁(10 nm)和一層較薄的電子致密的孢子外壁(2 nm)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，孢子外壁并不光滑，其上布滿細小褶皺和大量白色瘤狀物，疑似胞壁蛋白[1，5]。

2000年，研究人員在泰國生長緩慢的斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)上發(fā)現(xiàn)了一種未知的微孢子蟲[6]，其超微結(jié)構(gòu)特征符合腸胞蟲科，胞原質(zhì)團(plasmodia)在細胞質(zhì)中的位置以及小亞基核糖體RNA序列(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)與比氏腸胞蟲(Enterocytozoonbieneusi)相比存在16%的差異，被認為是一個新種，將其命名為蝦肝腸胞蟲[1]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，EHP可以感染斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)等養(yǎng)殖蝦類，導(dǎo)致其生長緩慢，且癥狀隨著感染的增加而加重，可能引起對蝦的慢性死亡[1，7-8]。

目前，EHP已經(jīng)在全世界各地的蝦養(yǎng)殖場中被檢測到，而EHP流行已經(jīng)對印度、泰國、中國、越南、馬來西亞、印度尼西亞等亞洲各國的養(yǎng)殖蝦業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[7，9-15]。本文重點就蝦肝腸胞蟲的傳播途徑、檢測方法和防治方面研究進展做綜述，旨在為今后高效檢測和防控EHP提供參考。

1 EHP的危害及傳播途徑

1.1 垂直傳播

EHP可以通過垂直傳播途徑即侵染親蝦的卵巢傳播至下一代。有研究發(fā)現(xiàn)，在感染EHP的凡納濱對蝦F1代的無節(jié)幼體、蚤狀幼體第一期和第二期中均能檢測到EHP的存在[16]。

1.2 水平傳播

EHP的水平傳播途徑相對復(fù)雜，目前已知健康蝦可以通過取食病蝦殘體、與病蝦合養(yǎng)等方式感染EHP，而在實驗室條件下通過飼喂病蝦肝胰腺組織或者注射純化的EHP對蝦血淋巴中也可使健康蝦感染EHP[16-19]。自然條件下，EHP可能存在多種傳播介體，健康蝦可通過取食攜帶EHP的介體而被感染，目前已有研究顯示鹵蟲可攜帶EHP[20]。在自然和實驗室條件下感染EHP的凡納濱對蝦中，通過組織學(xué)檢驗僅能在肝胰腺和中腸中觀察到EHP，而PCR檢測結(jié)果顯示，凡納濱對蝦的所有組織和器官中均可檢測到EHP，包括肝胰腺、中腸、血淋巴、鰓、肌肉和心臟等[18，21]。

目前對于EHP在蝦體內(nèi)的侵染路徑尚無系統(tǒng)性研究，研究主要集中于EHP在蝦肝胰腺中的分布情況、EHP感染蝦肝胰腺的過程和該過程中參與的蛋白。EHP可以通過侵染斑節(jié)對蝦的肝胰腺上皮小管細胞進入其細胞質(zhì)，并在其中完成生活史[1]。在EHP侵染蝦肝胰腺的過程中，EHP的胞壁蛋白EhSWP1可以和蝦肝胰腺上皮小管細胞表面的肝素(heparin)結(jié)合，再通過激發(fā)極管侵染蝦的細胞[22]。

1.3 EHP對宿主的影響

EHP被懷疑與斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦和羅氏沼蝦的生長遲緩癥狀相關(guān)[23]。EHP侵染凡納濱對蝦肝胰腺后，可以引起血淋巴中的總蛋白量和白蛋白量顯著上升，肝損傷指標丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(asparate transaminase, AST)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的量顯著上升，且感染EHP的蝦體質(zhì)量顯著低于健康蝦[18]。

2 EHP檢測方法

由于EHP孢子較小，在光學(xué)顯微鏡常規(guī)鏡檢下難以發(fā)現(xiàn)及鑒定，利用分子生物學(xué)技術(shù)是目前可行且具有靈敏度高、特異性好、檢測速度快等優(yōu)點的檢測方法。

2.1 PCR檢測技術(shù)

目前最常用的檢測蝦體內(nèi)攜帶EHP情況的方法即聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)。研究人員已經(jīng)建立基于18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA，18S rRNA)基因[24]、小亞基核糖體RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因[25]和胞壁蛋白(spore wall protein，SWP)基因序列[26]的PCR檢測技術(shù)，為了提高靈敏度和特異性，多數(shù)EHP檢測過程中會采用巢式PCR(nested-PCR)的方法。國內(nèi)研究人員對這3種方法在檢測凡納濱對蝦、鹵蟲和水樣中EHP的結(jié)果進行了比較，發(fā)現(xiàn)18S-PCR在第一步擴增時的靈敏度最高，而后2種方法均未檢出條帶；在第二步擴增上，SSU-PCR的靈敏度顯著高于SWP-PCR，但在分析了陽性PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)SSU-PCR存在假陽性條帶，因此，SWP-PCR的擴增特異性最高[27]。國外學(xué)者對SSU-PCR和SWP-PCR的檢測靈敏度也進行了比較，以連接SSU rRNA或SWP基因序列的pGEM-T質(zhì)粒為模板，利用巢式PCR技術(shù)，結(jié)果顯示，SSU-PCR技術(shù)只能檢測到質(zhì)粒拷貝數(shù)為106以上的模板，而SWP-PCR可以檢測最低拷貝數(shù)為104的模板；在對與EHP的SSU rRNA序列相似性較高的其他微孢子蟲的PCR檢測過程中，SSU-PCR會出現(xiàn)假陽性的情況，而SWP-PCR的特異性很好[26]。因此，在檢測蝦攜帶EHP情況過程中，建議使用SWP-PCR技術(shù)。

2.2 定量PCR技術(shù)

目前已經(jīng)建立的用于EHP檢測的實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)方法分別是SYBR Green I和TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法[8，28]。以Ct值≤30時檢測結(jié)果判定為陽性，TaqMan實時熒光定量PCR方法對EHP標準質(zhì)粒的檢測靈敏度為每μL 5.20×102拷貝數(shù)[28]，而SYBR Green I實時熒光定量PCR方法的檢測靈敏度為每μL 8.3×103拷貝數(shù)[8]，因此TaqMan qPCR方法的檢測靈敏度約為SYBR Green I qPCR方法的10倍左右。利用定量PCR檢測方法，不僅可以更靈敏的檢測EHP，也可以研究體長與EHP載量之間的關(guān)系，從而評估對蝦生長速率的風險水平[8]。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)

由于巢式PCR檢測方法和SYBR或Taqman定量檢測方法耗時較長，花費較高，且需要特定儀器進行實驗，2013年泰國學(xué)者建立了檢測EHP SSU rRNA基因的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，該方法使用納米金探針，所需實驗時間僅為50 min，靈敏度為巢式PCR的10倍，實驗結(jié)果直接可視且特異性良好[29]。隨后，2017年印度學(xué)者建立了實時定量LAMP檢測方法，其靈敏度與實時定量熒光PCR檢測方法相當，約為巢式PCR的100倍[30]。2018年印度學(xué)者建立了使用SYBR green I染料的可視化LAMP檢測方法，所需實驗時間更短，相比于巢式SWP-PCR檢測結(jié)果，LAMP的靈敏度約為其的95.31%，特異性約為98.98%，這對于田間檢測EHP來說是一種可利用的方法[31]。

2.4 組織學(xué)檢測方法

除了分子生物學(xué)檢測方法之外，病理檢測也是一種診斷病原和觀察病原宿主組織病理變化的重要方法，而良好的染色方法有利于研究人員將病原體與組織區(qū)分開，增加組織切片中病原的檢出率。目前最常用于檢測病理切片中EHP的染色方法為蘇木精-伊紅(haematoxylin and eosin, HE)染色法[1，18，24]。研究人員為了篩選出一種適用于EHP病理切片檢測的最佳染色方法，對包括蘇木精-伊紅(HE)染色法、Masson染色、愛顯藍-雪夫(AB-PAS)染色法、甲苯胺藍(TB)染色法、偉赫夫范吉森(EVG)染色法、勞克監(jiān)牢藍(LFB)染色法、天狼星紅(Sirius red)染色和普魯士藍(PB)在內(nèi)的8種染色方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)HE染色法對孢子的染色效果較差、與背景顏色對比不明顯且單個視野檢出率較低，而Masson染色結(jié)果顯示孢子呈現(xiàn)品紅色、與組織顏色對比明顯且檢出率最高。Masson染色法最適用于EHP病理切片檢測[32]。

由于微孢子蟲在HE染色處理后的病理切片中形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，難以區(qū)分EHP與其他微孢子蟲，其特異性上不如分子生物學(xué)檢測方法，因此，研究人員建立了原位雜交(in situ hybridization，ISH)檢測方法用于EHP的病理切片檢測[24]。利用帶有地高辛標記的EHP-18S rRNA探針進行原位雜交實驗，研究人員可以在感染EHP的凡納濱對蝦肝胰腺上皮小管細胞中觀察到陽性標記，而使用棉蝦病探針進行原位雜交時則沒有陽性標記，證明該方法具有特異性[24]。

3 EHP防治

目前尚無能夠有效防治蝦體內(nèi)EHP的報道，但根據(jù)EHP的流行病學(xué)特性，可以從以下幾個方面對EHP的傳播進行干預(yù)。首先，由于EHP存在垂直傳播的特性，因此，需要從源頭對EHP進行預(yù)防，即選育無EHP的親蝦，育種不攜帶EHP的蝦苗，同時科技人員需要檢測出廠的蝦苗，及時為農(nóng)戶提供信息。其次，由于EHP可以通過蝦的排泄物進入水體，因此，對于使用時間比較長的養(yǎng)殖塘，農(nóng)戶需要進行嚴格消毒，以清除殘留在塘底淤泥中的病原物。Aldama-Cano等[33]發(fā)現(xiàn)，在幾種不同條件下可以完全抑制EHP的孢子釋放(spore extrusion)，當在-20 ℃條件下處理2 h以上、在15 ppm的KMnO4溶液中處理15 min、在40 ppm的65%活性氯中處理15 min、在10 ppm的65%活性氯中處理24 h或在20%的乙醇中處理15 min時，EHP的孢子釋放率100%被抑制，這些方法對于蝦類養(yǎng)殖前的養(yǎng)殖場消毒或養(yǎng)殖過程中的循環(huán)水處理具有參考價值。此外，有研究發(fā)現(xiàn)控制水體的氨氮濃度在6.0～9.0 mg·L-1時可以有效減少凡納濱對蝦EHP的攜帶量[34]。由于病蝦可能在養(yǎng)殖過程中被健康蝦取食，EHP則可通過該途徑進行水平傳播，因此，農(nóng)戶需要及時處理病死蝦或可通過套養(yǎng)魚類來取食行動緩慢的病蝦，從而有效控制疾病擴散。最后，可以通過增強養(yǎng)殖蝦的體質(zhì)來增加其對病原物的抵抗力，例如在飼料中添加水產(chǎn)用維生素和鈣片，或者利用RNA干擾的方法，提前讓蝦攝入抑制EHP孢子釋放的雙鏈RNA，增強蝦對EHP的抵抗力。綜上，防治蝦肝腸胞蟲需要遵循“預(yù)防為主、防治結(jié)合”，優(yōu)先選育無EHP親蝦和蝦苗，結(jié)合養(yǎng)殖塘嚴格清理、水源控制、病蝦及時清理和增強蝦體質(zhì)，做到“無病預(yù)防，有病早治”。