固定化脂肪酶催化紅花油乙醇醇解反應(yīng)的研究

竺少銘1，王升帆2，吳 鵬，張石自，鄭建永，汪 釗

(1.浙江醫(yī)藥股份有限公司 昌海生物分公司，浙江 紹興 312000；2.浙江醫(yī)藥股份有限公司 新昌制藥廠，浙江 新昌 312500；3.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

紅花油又名紅花籽油，由紅花籽制備而來。紅花油中含有大量的不飽和脂肪酸，營養(yǎng)價(jià)值極高，主要成分為亞油酸，國標(biāo)中規(guī)定紅花油中亞油酸含量最低為67.8%。而且紅花油具有很高的醫(yī)用價(jià)值，是制備亞油酸乙酯的良好原料[1]。目前，國內(nèi)外制備脂肪酸乙酯可分為化學(xué)法和酶法兩種。化學(xué)法雖然成本低，但污染大、設(shè)備要求高，回收利用率不高。劉志強(qiáng)等[2]研究菜籽油乙醇醇解，以正己烷為溶劑，以LVK脂肪酶催化反應(yīng)，分三步添加乙醇，最終酯化率可達(dá)到93%。張振乾等[3]用自制脂肪酶催化菜籽油乙醇醇解反應(yīng)，酯化率可達(dá)92.91%。Dalla等[4]用Novozym 435催化大豆油和乙醇反應(yīng)，酯化率為85%。相對于化學(xué)法，用酶法催化紅花油制備脂肪酸乙酯具有廣闊的應(yīng)用前景。固定化技術(shù)的發(fā)展有效降低了酶的使用成本，促進(jìn)酶催化反應(yīng)的工業(yè)化應(yīng)用[5-6]。筆者團(tuán)隊(duì)制備的固定化酶成本比商品化酶低、穩(wěn)定性高，能降低成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又稱三?；视王；饷福瑥V泛存在于動(dòng)植物和微生物中，且具有多種催化功能特性[8-9]。微生物來源的脂肪酶具有催化活性較高、多樣性、便于基因操作、穩(wěn)定性好和原料易得等優(yōu)點(diǎn)，因此成為商品化脂肪酶的主要來源。脂肪酶能夠在油-水界面進(jìn)行催化，包括水相中催化酯水解反應(yīng)，有機(jī)相中催化酯合成、酯交換等多種反應(yīng)，在水相、微水相和兩相催化體系中保持高活性、高穩(wěn)定性、高區(qū)域選擇性和高立體選擇性，因此被廣泛應(yīng)用在油脂水解和改性、洗滌劑生產(chǎn)、造紙工業(yè)、皮革加工以及手性合成等領(lǐng)域[9-10]。筆者利用自制的固定化脂肪酶催化紅花油乙醇醇解反應(yīng)，對該催化反應(yīng)的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固定化CandidaanatarcticB脂肪酶(Novozym 435)、固定化Rhizomucormiehei脂肪酶(Lipase RM IM)和Thermomyceslanuginosus脂肪酶(Lipase TL IM固定化酶和Lipozyme TL100L液體酶)，購自丹麥Novo Nordisk公司；固定化Burkholderiacepacia脂肪酶(Lipase PS IM)，購自日本Amano公司；紅花油，購自嘉吉集團(tuán)；大孔吸附樹脂D101，購自鄭州勤實(shí)科技有限公司；乙醇、石油醚(分析純)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

臺式恒溫水浴搖床(HWY-2112)，上海智誠分析儀器制造有限公司；氣相色譜儀(Agilent6890)，美國安捷倫科技公司；電子分析天平(B2-2FA2004)，上海世義精密儀器有限公司；氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A/5975C)，美國安捷倫公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Hei-VAP)，德國Heidolph公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酶的固定化方法

稱取10 g吸去水分后的凈品級大孔吸附樹脂D101(已經(jīng)過預(yù)處理，包括酸堿處理、乙醇浸泡和蒸餾水清洗)。取40 mL的脂肪酶酶液Lipozyme TL100L，裝于50 mL錐形瓶中，密封。將稱取好的樹脂加入裝有酶液的錐形瓶中，30 ℃水浴，搖床振蕩速率150 r/min，固定反應(yīng)5 h。吸附完成后加0.25%聚乙烯亞胺，混勻，繼續(xù)30 ℃水浴，搖床振蕩速率150 r/min，吸附交聯(lián)固定1 h。用叔丁醇洗滌固定化酶，抽濾，45 ℃真空干燥得到固定化脂肪酶，密封保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 固定化酶催化紅花油乙醇醇解反應(yīng)

取10 mL離心管，加入0.8 mL的紅花油，再分別加入乙醇0.4 mL和有機(jī)溶劑0.8 mL，稱取0.016 g固定化脂肪酶，混合搖勻，置于恒溫水浴搖床中反應(yīng)3 h，轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)結(jié)束后取出部分樣品進(jìn)行氣相色譜檢測。

1.2.3 氣相色譜檢測分析方法

采用氣相色譜檢測亞油酸乙酯含量。用移液器取酶催化反應(yīng)液10 μL至氣相樣品瓶，再加入990 μL乙酸乙酯稀釋后進(jìn)行氣相色譜檢測。色譜柱為DB-23石英毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器；檢測條件為柱溫220 ℃，恒溫保持10 min，進(jìn)樣溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，載氣為高純氮?dú)猓鶋?07.27 kPa；尾吹氣流量24.0 mL/min；分流比20∶1。

1.2.4 相對轉(zhuǎn)化率計(jì)算

紅花油化學(xué)堿法醇解反應(yīng)的亞油酸乙酯氣相色譜峰面積為S，酶催化反應(yīng)3 h得到的峰面積為S1，亞油酸的相對轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式為

(1)

1.2.5 氣質(zhì)聯(lián)用分析方法

GC-MS分析條件(Agilent 7890N/5975C)：氣相色譜柱型號HP-5 MS，進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比100∶1；柱流速1 mL/min；柱溫箱溫度起初100 ℃保持2 min，10 ℃/min 升溫至250 ℃保持8 min；輔助加熱區(qū)溫度250 ℃；MS四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃。EI+轟擊源，全掃描模式掃描，掃描質(zhì)量范圍30～500 amu，發(fā)射電流200 μA，電子能量70 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化脂肪酶的篩選

筆者考察了不同商品化和自制固定化脂肪酶對紅花油乙醇醇解反應(yīng)的催化影響，反應(yīng)條件如1.2.2所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。自制的固定化脂肪酶催化的相對轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到43.2%，催化轉(zhuǎn)化率比Novozym 435和Lipozyme TL IM高出近1倍。因此對自制固定化脂肪酶催化紅花油乙醇醇解反應(yīng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

1—Novozym 435；2—Lipase TL IM；3—Lipase RM IM；4—Lipase PS IM；5—自制固定化酶。圖1 固定化脂肪酶的篩選Fig.1 The screening of immobilized lipases

2.2 有機(jī)溶劑對轉(zhuǎn)化率的影響

有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)對底物的相對溶解度、酶的催化活性和穩(wěn)定性有一定的影響，而酶的催化活性與溶劑的疏水性大小(LogP)有很大關(guān)系[11]。LogP在一定程度上可以作為溶劑極性的定量表達(dá)，LogP值越高，溶劑的疏水性越強(qiáng)，對酶催化的影響也越小[12]。為了確定最適反應(yīng)介質(zhì)，實(shí)驗(yàn)考察了甲苯(1)、二氯甲烷(2)、乙醚(3)、石油醚(4)、丙酮(5)、叔丁醇(6)、正己烷(7)和環(huán)己烷(8)等反應(yīng)溶劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，石油醚作為反應(yīng)溶劑時(shí)相對轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到58.5%，故取石油醚作為反應(yīng)溶劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 有機(jī)溶劑對酶催化紅花油乙醇醇解的影響Fig.2 The effect of organic solvents on lipase catalyzed ethanolysis of safflower oil

2.3 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

由酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)得出溫度升高反應(yīng)速度加快[13]。但過高的溫度會破壞酶的三級結(jié)構(gòu)，從而降低反應(yīng)速率，同時(shí)溫度的改變對有機(jī)溶劑黏度的影響也會影響轉(zhuǎn)化率。筆者考察了不同溫度(30，35，40，45，50 ℃)對轉(zhuǎn)化率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。隨著溫度升高，相對轉(zhuǎn)化率增加，溫度為45 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到73.3%，隨后下降。這可能是由于溫度影響石油醚的黏度和傳質(zhì)阻力導(dǎo)致的。因此選擇45 ℃作為反應(yīng)溫度。

圖3 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The effect of reaction temperature on conversion rate

2.4 乙醇添加量對轉(zhuǎn)化率的影響

紅花油的乙醇醇解反應(yīng)本質(zhì)上是酯交換反應(yīng)，是一種可逆反應(yīng)，所以醇油比的升高有利于正反應(yīng)的發(fā)生，提高轉(zhuǎn)化率。在紅花油添加量不變的條件下改變乙醇添加量，對醇油體積比因素進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。隨著醇油比的增加，相對轉(zhuǎn)化率大幅提高，當(dāng)醇油體積比為1∶4時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到79.5%，隨后又慢慢降低。這可能由于乙醇極性變大造成SN2型親核取代反應(yīng)速率下降，影響轉(zhuǎn)化率。此外乙醇量過多，影響了脂肪酸乙酯與甘油的分層效果，也影響后續(xù)的回收利用。

圖4 乙醇添加量對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 The effect of the addition of ethanol on conversion rate

2.5 石油醚添加量對轉(zhuǎn)化率的影響

石油醚的添加量對紅花油乙醇醇解反應(yīng)也有一定的影響。由圖5可知：當(dāng)石油醚與紅花油的體積比增大時(shí)，相對轉(zhuǎn)化率提高。但當(dāng)體積比超過1時(shí)，轉(zhuǎn)化率就顯著下降，這可能是因?yàn)檫^量的石油醚阻礙了紅花油與乙醇的接觸，從而降低了轉(zhuǎn)化率，所以最適的石油醚與紅花油體積比為1∶1，此時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到73.2%。

圖5 石油醚添加量對醇解反應(yīng)的影響Fig.5 The effect of the addition of organic solvent on ethanolysis reaction

2.6 酶添加量對轉(zhuǎn)化率的影響

實(shí)驗(yàn)考察了酶質(zhì)量濃度(20，25，30，35，40 g/L)對轉(zhuǎn)化率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。酶質(zhì)量濃度為20～35 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率逐漸升高，最高達(dá)到79.6%，這是由于酶活性中心沒有飽和，所以酶質(zhì)量濃度越高轉(zhuǎn)化率越高；隨后轉(zhuǎn)化率降低，因?yàn)槊纲|(zhì)量濃度過高，底物有限，導(dǎo)致催化效率降低。因此選擇35 g/L作為酶的最適添加量。

圖6 酶質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 The effect of enzyme loading on conversion rate

2.7 酶催化反應(yīng)的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

選擇以上對固定化脂肪酶催化紅花油乙醇醇解反應(yīng)有一定影響的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)正交因素水平表，如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

表2，3為不同組合的各因素對自制固定化酶催化紅花油乙醇醇解反應(yīng)的影響結(jié)果，通過對反應(yīng)后紅花油轉(zhuǎn)化率的極差分析可知：4 個(gè)因素的影響顯著性依次為乙醇添加量>酶量>溶劑添加量>溫度，最優(yōu)組合為A3B3C1D2，考慮到能耗，溫度45 ℃和50 ℃的極差很接近，故選擇A2B3C1D2，即溫度45 ℃、乙醇與紅花油體積比為1∶4、石油醚與紅花油體積比為1∶2、酶質(zhì)量濃度為35 g/L。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下相對轉(zhuǎn)化率達(dá)到77.7%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

2.8 酶催化醇解反應(yīng)的時(shí)間曲線

通過單因素優(yōu)化和正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)的條件，考察了固定化脂肪酶催化紅花油醇解反應(yīng)的時(shí)間曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。反應(yīng)時(shí)間在0～18 h范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶催化反應(yīng)的相對轉(zhuǎn)化率逐漸增大，18 h時(shí)達(dá)到最高，隨后稍有減小。因此該反應(yīng)條件下的最佳反應(yīng)時(shí)間為18 h，此時(shí)相對轉(zhuǎn)化率可達(dá)98.8%。

圖7 酶催化反應(yīng)時(shí)間曲線Fig.7 Time curve of enzyme catalytic reaction

2.9 氣質(zhì)聯(lián)用分析酶催化產(chǎn)物

通過酶催化反應(yīng)，按最優(yōu)條件：固定化酶0.016 g，紅花油0.8 mL，乙醇0.3 mL，石油醚0.8 mL，在45 ℃水浴中振蕩18 h，反應(yīng)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除下層甘油，取上層液體稀釋100倍后進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析，總離子流色譜圖如圖8所示。

圖8 氣質(zhì)聯(lián)用測定總離子流色譜圖Fig.8 The determination of total ion chromatogram of fatty acid ethyl ester by GC/MS

通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫軟件NIST08檢索化合物結(jié)構(gòu)，根據(jù)豐度圖峰面積比例計(jì)算不同脂肪酸乙酯的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由表4可知：紅花油產(chǎn)物中含有5種脂肪酸乙酯，分別為棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、油酸乙酯、亞麻酸乙酯和硬脂酸乙酯，其中亞油酸乙酯相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)68.5%。

表4 氣質(zhì)聯(lián)用測定紅花油酶催化產(chǎn)物中脂肪酸乙酯相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)
Table 4 The analysis of determination of relative content of fatty acids in safflower oil by GC/MS

保留時(shí)間/min名稱相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%14.990棕櫚酸乙酯8.9816.595亞油酸乙酯68.5016.636油酸乙酯14.2016.692亞麻酸乙酯2.0616.857硬脂酸乙酯7.34

3 結(jié) 論

利用自制的固定化脂肪酶催化紅花油乙醇醇解反應(yīng)，并與商品化脂肪酶催化反應(yīng)的效果進(jìn)行比較，相對轉(zhuǎn)化率要高于Lipozyme TL IM 和Novozym 435。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳催化工藝條件：反應(yīng)溫度為45 ℃、紅花油和乙醇體積為4∶1、紅花油和石油醚體積比為2∶1、酶質(zhì)量濃度為35 g/L、反應(yīng)時(shí)間為18 h，在此條件下轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.8%。對兩步反應(yīng)后的紅花油進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)紅花油醇解產(chǎn)物中主要含有5種脂肪酸乙酯，亞油酸乙酯相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為68.5%，其次為油酸乙酯14.2%，按含量從大到小依次為棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯和亞麻酸乙酯。