離體條件下評價二倍體馬鈴薯(Solanum phureja×S.stenotomum)耐鹽性

趙明輝 白雅梅 呂文河

(1哈爾濱學院食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150086；2東北農業(yè)大學農學院,黑龍江哈爾濱 150030；3東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院,黑龍江哈爾濱 150030)

鹽堿土是陸地上廣泛分布的一種土壤類型,全世界約有9.5億hm2的鹽漬化土壤[1]。我國鹽堿地面積約有1億hm2,主要分布在東北、西北、華北內陸以及沿海地區(qū)等[2]。同時,受氣候、人為等因素的影響,土壤的次生鹽漬化日趨嚴重。而在鹽堿地上種植耐鹽作物,不但可以改良鹽堿地,還可以緩解目前我國耕地面積不足的現(xiàn)狀,進而提高土地利用率[3]。因此,培育耐鹽作物品種具有重要意義。近年來,大量研究者對小麥[4-5]、水稻[6-7]、玉米[8-9]、大豆[10-11]、高粱[12]、棉花[13-14]等作物進行了種質資源耐鹽性鑒定與篩選,并表明耐鹽種質資源的多樣性越豐富,改良栽培品種或選育新品種的潛力就越大。但目前關于馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)種質資源耐鹽性鑒定與篩選的研究并不常見。

馬鈴薯是糧、菜、飼和工業(yè)原料兼用的重要農作物,也是鹽中度敏感作物[15-16]。目前生產上應用的馬鈴薯品種屬于普通栽培種,為同源四倍體,其親本材料遺傳基礎較狹窄[17],而二倍體馬鈴薯中蘊含多種有價值的基因[18-20],如富利亞(S.phureja,PHU)和窄刀薯(S.stenotomum,STN)的雜種群體(PHU-STN),是美國研究者經過12次輪回選擇改良的適應長日照的原始二倍體栽培種雜種群體,其具有豐富的遺傳變異性,是拓寬馬鈴薯遺傳背景的重要種質資源[21]。

離體植物培養(yǎng)能在植物不同的發(fā)育階段鑒定植物耐受脅迫的潛力[22]。目前已有研究者利用組織培養(yǎng)技術研究馬鈴薯的耐鹽性,如Zhang等[23]分別利用單莖段、根尖和微型薯組織培養(yǎng)鑒定馬鈴薯的耐鹽性,發(fā)現(xiàn)3種培養(yǎng)方式下馬鈴薯的耐鹽性一致,且單莖段培養(yǎng)操作更方便；姜麗麗等[24]在組培條件下通過測定株高、莖葉鮮重、根鮮重等9個指標鑒定了10個馬鈴薯品種的耐鹽性；周明揚[25]在組培條件下通過測定株高、植株鮮重等4個形態(tài)指標和葉綠素含量、脯酸含量等4個生理指標鑒定了4個馬鈴薯品種的耐鹽性。以上研究多針對四倍體馬鈴薯栽培品種的耐鹽性鑒定,而對二倍體馬鈴薯種質資源的耐鹽性評價研究鮮見報道。本研究在組織培養(yǎng)條件下,以166個二倍體馬鈴薯PHU-STN雜種無性系試管苗為試驗材料,通過NaCl脅迫,測定芽長、芽鮮重、芽干重、根長、根鮮重和根干重6個形態(tài)指標,評價二倍體馬鈴薯無性系的耐鹽性,以期為快速評價大量馬鈴薯種質資源的耐鹽性和馬鈴薯耐鹽育種提供理論依據(jù)和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為166個二倍體栽培種PHU-STN雜種無性系,包括164個后代無性系和其親本(母本472-1為耐鹽親本,父本270-2為鹽敏感親本)。親本經NaCl脅迫篩選而來,以四倍體馬鈴薯品種Bintje(母本)為耐鹽對照,以Mainechip(父本)為鹽敏感對照進行品種篩選[26]。

將親本雜交后獲得的實生種子約350粒浸泡消毒后,接種至MS培養(yǎng)基上,置于溫度20±2℃,光照強度2 000～3 000 Lx,光周期16 h光照/8 h黑暗的組培室內培養(yǎng),約有180粒種子發(fā)芽并長成幼苗,進行擴繁保存。每粒實生種子為一個基因型,最后能被保存下來并被用于試驗的共164個基因型,即164個后代無性系。

1.2 試驗方法

參考Zhang等[23]和張景云[26]的方法,分別進行40、80 和 120 mmol·L-1NaCl脅迫的預備試驗,試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn),NaCl濃度過高會導致有些無性系不萌發(fā)新葉芽,或長出葉芽后停止生長,甚至死亡；NaCl濃度過低不能很好地區(qū)分出無性系間的耐鹽性差異,因此,本研究選擇80 mmol·L-1NaCl進行脅迫處理(pH值5.8),以0 mmol·L-1NaCl處理為對照(CK,pH值5.8)。分別取166個無性系21 d苗齡的組培苗,去除頂端和最下部,剪成約1 cm長并帶有1個葉芽的莖段,分別接種至含有 0 mmol·L-1和 80 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上,每個濃度接種5瓶,培養(yǎng)瓶為裝有40 mL培養(yǎng)基的100 mL三角瓶,每瓶接種10個莖段,置于溫度20±2℃,光照強度2 000～3 000 Lx,光周期16 h光照/8 h黑暗的組培室內培養(yǎng)。培養(yǎng)28 d后,選取瓶內組培苗未被污染的培養(yǎng)瓶進行形態(tài)指標的測定,每個濃度隨機取3瓶。形態(tài)指標包括芽長、芽鮮重、芽干重、根長、根鮮重和根干重。其中,芽長為莖段生長點至苗頂端的長度；根長為根中最長的根的長度；干重為105℃殺青15 min后,70℃烘干至恒重的重量[22]。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003和統(tǒng)計軟件DPS 7.05[27]進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析(包括方差分析、相關分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析和廣義遺傳力的估算)。由于形態(tài)指標的相對值能夠消除無性系間固有的遺傳差異,比絕對值更能準確反映出無性系間耐鹽能力的差異,因此,統(tǒng)計分析均使用各處理的相對值[28-29](以下簡稱“相對值”):

1.3.1 耐鹽綜合評價D值的計算 運用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法對相對值進行標準化處理[30-31],公式為:

式中,X(ij)表示i基因型j指標的隸屬值；Xij表示i基因型j指標的測定值；Xjmax、Xjmin分別表示j指標的最大值和最小值。

權重確定采用標準差系數(shù)法,用公式(3)計算標準差系數(shù)Vj,公式(4)歸一化后得到各個形態(tài)指標的權重系數(shù)Wj:

二倍體馬鈴薯雜種無性系的耐鹽綜合評價D值計算公式為:

1.3.2 聚類分析方法 分別利用芽長、芽鮮重、芽干重、根長、根鮮重和根干重6個形態(tài)指標相對值和綜合評價D值,對166個無性系(2個親本+164個后代)進行聚類分析,聚類距離為歐氏距離,聚類分析方法為離差平方和法。

1.3.3 廣義遺傳力(h2)估算公式 以無性系平均值為單位,廣義遺傳力估算公式為:

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下親本和PHU-STN雜種后代的耐鹽表現(xiàn)

由表1可知,NaCl脅迫處理下,無性系間的芽長、芽鮮重、芽干重、根長、根鮮重和根干重相對值均存在極顯著差異。親本和后代無性系的生長均受到不同程度的抑制,表現(xiàn)為芽長和根長變短,根數(shù)變少或部分無性系的根長變短,一些鹽敏感無性系甚至不能生出新的葉芽。除根長相對值的平均值外,各后代無性系其他5個形態(tài)指標相對值的平均值均＜34,后代無性系的根長相對值平均值較高,為62.5。鹽敏感親本的6個形態(tài)指標的相對值的均明顯低于耐鹽親本(根長相同)；PHU-STN雜種后代群體6個形態(tài)指標的相對值的最小值均小于鹽敏感親本(根長相同),最大值均大于耐鹽親本,且無性系間的6個形態(tài)指標相對值的差異均極顯著；6個形態(tài)指標均表現(xiàn)出較高的廣義遺傳力(均大于0.85),其中芽長的廣義遺傳力最高,達0.931 1,根干重的廣義遺傳力最低,為0.860 8。

2.2 NaCl脅迫下PHU-STN雜種無性系耐鹽性綜合評價

由表2可知,芽長、芽鮮重、芽干重、根長,根鮮重和根干重相對值最大的無性系分別為A255、A108、A038、A014、A117和 A096。根據(jù)單一指標對親本和164個無性系耐鹽性強弱排序結果表現(xiàn)出不同程度的差異,芽長、芽鮮重、芽干重、根長、根鮮重和根干重對各無性系耐鹽性貢獻率的權重系數(shù)分別為 0.151 8、0.269 3、0.096 2、0.138 1、0.167 8 和 0.176 9。將隸屬函數(shù)值與權重系數(shù)復合運算得到各無性系耐鹽性的綜合評價D值,D值越大,耐鹽性越強。篩選出A108、A038、 A024、 A002、 A152、 A096、 A003、 A013、 A200、A053、 A066、 A231、 A139、 A016、 A120、 A233、 A254、A100、A255、A072、A050、A117、A238、A107、A069 和A167共26個無性系的D值高于耐鹽親本472-1。由表 3 可知,A077、A229、A106、A080、A153、A103、A032、A094、A115和A262共10個無性系的D值低于鹽敏感親本270-2,這些無性系是進行馬鈴薯耐鹽性遺傳學研究和耐鹽新品種選育的重要種質資源。

表1 NaCl脅迫下親本和后代形態(tài)指標值相對值Table 1 Relative value of morphological traits of parents and progeny under NaCl stress

2.3 6個形態(tài)指標及綜合評價D值的相關分析

由表4可知,各個形態(tài)性狀間均存在極顯著的正相關。芽長與芽鮮重和芽干重的相關系數(shù)均較高,分別為0.83和0.76,芽鮮重與芽干重的相關系數(shù)最高,為0.92；根干重與芽鮮重(0.69)、芽干重(0.74)、根長(0.63)及根鮮重(0.59)的相關系數(shù)均大于0.5,其他性狀間的相關系數(shù)均小于0.5；綜合評價D值與6個形態(tài)指標相對值也均存在極顯著的正相關,且相關系數(shù)均大于0.6,表明綜合評價D值可以全面反映各無性系的耐鹽性。

表4 6個形態(tài)指標相對值與D值的相關分析Table 4 Correlation between relative values of six morphological traits and D value

2.4 聚類分析

分別利用6個形態(tài)指標相對值和綜合評價D值,對166個無性系進行聚類分析。由表5可知,2種方法均將166個無性系分為四個類群,但相同類群所包含的無性系存在差異,其中有一些無性系是被共同包含在同一類群的(表中加黑的無性系),第一類群中共同包含24個無性系,第二類群中共同包含36個無性系,第三類群中共同包含51個無性系,第四類群中共同包含24個無性系。由表6可知,第一類群到第四類群的每個形態(tài)指標相對值的平均值呈由大到小的順序排列,因此,第一類群為強耐鹽組,第二類群為中耐鹽組,第三類群為弱耐鹽組,第四類群為鹽敏感組。此外,第一類和第二類群相比,根長相對值平均數(shù)的差異較小,說明與芽長、芽鮮重、芽干重、根鮮重和根干重相比,根長并非理想的形態(tài)篩選指標。綜上,在進行耐鹽篩選工作中,若無可參考對照,可以考慮用2種方法分別聚類,然后篩選出在同一類群中共同包含的無性系,以便提高篩選的精確性。

表5 各無性系在不同類群中的分布Table 5 Distribution of clones in different clusters

表6 不同類群中各無性系6個形態(tài)指標相對值的平均值Table 6 The average of relative values of six morphological traits of clones distributed in different clusters

3 討論

由于單一的形態(tài)指標所反映的各無性系間的耐鹽性強弱通常具有一定的局限性,只有通過對多項指標進行綜合評價才能客觀評價各無性系耐鹽性的強弱[30]。目前運用較為廣泛的抗逆性綜合評定方法為隸屬函數(shù)法,如戴海芳等[13]利用出芽率、幼苗鮮重等11個指標的隸屬函數(shù)值評價了17個棉花品種的耐鹽性；潘俏等[33]利用株高、根長等13個指標的隸屬函數(shù)值評價了12個黃瓜耐鹽突變體的耐鹽性；張會麗等[8]利用產量、K+/Na+等20個指標的隸屬函數(shù)值評價10個玉米品種的耐鹽性；張巧鳳等[34]根據(jù)芽期相對鹽害指數(shù)及苗期相對根長的隸屬函數(shù)值評價了24份小麥種質資源的耐鹽性。本研究利用芽長、芽鮮重、芽干重、根長、根鮮重和根干重6個形態(tài)指標的隸屬函數(shù)值綜合評價了164份二倍體馬鈴薯無性系的耐鹽性。由于試驗材料數(shù)量較多,僅測定了6個形態(tài)指標,在后續(xù)的研究中,可以通過測量多個生理指標對已篩選出的26個耐鹽無性系和10個鹽敏感無性系的耐鹽性進行更精確的評價。

本研究中,后代無性系根長相對值的平均值為62.5,其中有5個無性系的根長相對值高于100,最大值為124.2。在測量過程中發(fā)現(xiàn),芽長值大的無性系多表現(xiàn)為根數(shù)也多,但根長并不一定長,而芽長值小的無性系多表現(xiàn)出根數(shù)很少,而根長卻很長,說明鹽脅迫抑制鹽敏感無性系長出更多的根,耐鹽無性系可以通過較多的根吸收營養(yǎng)以維持生長,而鹽敏感無性系受鹽脅迫不能長出更多的根,只能通過根的變長來吸收營養(yǎng),這與郭建榮等[35]和谷俊等[36]的研究結果一致。此外,聚類分析結果表明,第一類群和第二類群的根長相對值的差異較小,也說明根長可能不是理想的形態(tài)篩選指標。因此,今后在組織培養(yǎng)條件下對馬鈴薯無性系進行耐鹽性評價時,可以考慮用主根數(shù)代替根長,作為耐鹽篩選的形態(tài)指標之一。

對于像馬鈴薯這樣的無性繁殖作物來說,性狀的廣義遺傳力對于育種選擇具有重要的指導意義,因為從獲得雜交種子起,無論基因型是否純合,由于其無性繁殖特性,都不再分離,因而在分離的群體中進行選擇是有效的[37]。另外,如果二倍體馬鈴薯能夠產生未減數(shù)花粉(即2n花粉),且是第一次分裂重組型(firstdivision restitution,FDR),在 4x-2x雜交組合中,可以將二倍體馬鈴薯約80%的異質性傳遞給其四倍體后代[38],表明,估算研究性狀的廣義遺傳力,在4x-2x雜交育種中具有重要意義。本研究中,在NaCl脅迫下所估算6個形態(tài)指標的廣義遺傳力值均大于0.85,說明NaCl脅迫下這幾個性狀主要由遺傳因素控制,受環(huán)境影響較小,與前人研究一致[37,39-40]。因此,在今后的工作中,可以將耐鹽性強的無性系移栽至大田,待開花后,檢測是否產生2n花粉。有2n花粉的無性系,可通過4x-2x雜交將耐鹽基因轉移至四倍體栽培種中,拓寬現(xiàn)有馬鈴薯種質資源的耐鹽遺傳背景,從而為選育出耐鹽性強的四倍體栽培品種奠定基礎。

4 結論

本研究篩選出26個耐鹽無性系和10個鹽敏感無性系；形態(tài)指標和綜合評價D值2種方法均將166個無性系分為4個類群；根長不是理想的形態(tài)篩選指標,后續(xù)研究可用主根數(shù)替代根長,作為耐鹽篩選的形態(tài)指標之一。今后的研究可利用篩選出的無性系進行耐鹽盆栽試驗,進一步更準確地評價其耐鹽性,以用于耐鹽育種。本研究結果為快速評價大量馬鈴薯種質資源的耐鹽性和馬鈴薯耐鹽育種提供了理論依據(jù)和材料基礎。