免疫熒光抗體法檢測水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲

莫婉湫， 賴競峰， 劉曉穎

(東莞市東江檢測有限公司，廣東 東莞 523000)

賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲(簡稱“兩蟲”)是寄生于人和動物體內(nèi)的致病性原生動物［1］?！皟上x”的潛伏期長、個體小、致病率高，而且對氯消毒劑具有較強的抗性［2］，影響供水安全［3］。《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)規(guī)定了飲用水中“兩蟲”的限值為＜1個/10L。

目前“兩蟲”的檢測方法主要有免疫熒光法［4－6］、ICR 法、PCR 法［7－8］等。其中 ICR 法應(yīng)用最早，但檢測準(zhǔn)確性較低［1－2］;PCR法由于需要進(jìn)行基因檢測，暫未得到廣泛應(yīng)用;免疫熒光法是目前國內(nèi)外使用最廣泛、發(fā)展最迅速的方法。筆者分別用Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法過濾濃縮水樣，將離心收集到的賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲進(jìn)行免疫磁分離和熒光抗體染色，同時通過測試和優(yōu)化各試驗步驟，探討了檢測過程中的影響因素，以期提高水中“兩蟲”的回收率。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗儀器:IDEXX Pressure Elution型快速淘洗裝置、FM－3800型臺式離心機(jī)、Pall帶臂水平振蕩器、DD－5M型離心機(jī)、DJ－1型磁力攪拌器，Barnant Masterflex L/S Easy－Load II型蠕動泵、Dynal樣品混合器、VWR渦旋混合器、免疫磁混旋器、Olympus BX 51型熒光顯微鏡、Dynal L10側(cè)平面試管、IEDXX快速濾芯、Pall褶聚醚砜濾紙濾囊。

實驗試劑:免疫熒光染色試劑EsayStain、質(zhì)控標(biāo)樣ColorSeed、免疫磁分離試劑盒、固封劑、淘洗緩沖液，實驗用水為純水。

1.2 水樣的采集

按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》(GB/T 5750—2006)進(jìn)行水樣的采集、保存和運輸。

1.3 實驗方法

1.3.1 富集濃縮

① Envirochek方法

在磁力攪拌器上邊攪拌邊過濾水樣，流速為2 L/min，打開排氣閥排氣，待濾囊內(nèi)注滿水后關(guān)閉排氣閥。過濾完畢用純水沖洗采樣容器，一并過濾。每個濾囊中加入110 mL淘洗液后插到帶臂水平振蕩器上，控制排氣口在12點方向，以900 r/min振蕩10 min，將濾囊中的淘洗液全部倒入250 mL錐形離心瓶。再加入110 mL淘洗液到濾囊中，將排氣口設(shè)置在4點和8點方向，各振蕩5 min，然后將濾囊中的淘洗液全部倒入250 mL錐形離心瓶中。將離心瓶置于離心機(jī)中，1500 g離心15 min，自然減速以避免擾亂沉淀物。

② Filta－Max Xpress快速方法

在磁力攪拌器上邊攪拌邊過濾水樣，流速為4 L/min。過濾完畢用純水沖洗采樣容器，一并過濾。用Pressure Elution型快速淘洗裝置進(jìn)行淘洗，用500 mL錐形離心瓶收集淘洗液。將離心瓶置于離心機(jī)中，2 000 g離心15 min，自然減速以避免擾亂沉淀物。

兩種富集濃縮方法都要在不擾亂沉淀物的情況下吸走上清液，根據(jù)壓實沉淀物體積計算出需保留的體積。若沉淀物體積≤0．5mL，保留10 mL液體;當(dāng)沉淀物體積大于0．5 mL時，則保留體積為沉淀物體積的20倍。

1.3.2 免疫磁分離

定量轉(zhuǎn)移10 mL水樣濃縮物到側(cè)平面試管中，加入1 mL buffer A試劑和1 mL buffer B試劑，再加入賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲磁珠各100μL。將側(cè)平面試管置于免疫磁混旋器上，混合1 h。在磁珠捕獲“兩蟲”后，用免疫磁濃縮器的磁極將其與水中其他雜質(zhì)分離。加入0．1 mol/L鹽酸50μL使磁珠上的“兩蟲”解離，轉(zhuǎn)移解離液至玻片內(nèi)。重復(fù)操作1次，收集二次酸化的解離液于另一玻片內(nèi)，每個玻片預(yù)先滴加5μL 1 mol/L氫氧化鈉。

1.3.3 熒光抗體染色

4.信息技術(shù)和制造技術(shù)相互融合。20世紀(jì)80年代中后期，日本的信息技術(shù)和生產(chǎn)技術(shù)已相互融合，大量信息技術(shù)開始應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程中，豐田生產(chǎn)模式(多品種、小批量、局部柔性化制造的流水線生產(chǎn))開始流行。計算機(jī)在制造工藝和生產(chǎn)過程中廣泛應(yīng)用，各種計算機(jī)輔助軟件，如計算機(jī)輔助制造(CAM)、計算機(jī)輔助工藝過程設(shè)計(CAPP)、計算機(jī)輔助測試(CAT)[8]等進(jìn)一步提升了制造過程的智能化程度，為開展智能制造打下良好基礎(chǔ)。各類先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)的雛形開始出現(xiàn)并投入生產(chǎn)，如加工中心(MC)機(jī)械、自動主體倉庫、機(jī)器人、柔性制造系統(tǒng)(FMS)等，進(jìn)一步實現(xiàn)了制造產(chǎn)品種類的多樣化和生產(chǎn)過程的柔性化。

將玻片于37℃培養(yǎng)箱干燥(干燥時間最長為1 h)，加入50μL甲醛，干燥。

熒光染色:加入50μL Easystain到玻片中，濕盒在37℃下避光培養(yǎng)30 min以上，吸掉液體，加入100μL PBS并靜置2 min，吸除多余的PBS。

DAPI染色:加入50μL DAPI染色液到玻片中，室溫靜置2 min后吸掉過量的液體，加入50μL純水，靜置1 min后吸掉多余的純水。加1滴固封劑后加蓋玻片，避免氣泡。

1.3.4 鏡檢

用熒光顯微鏡對玻片進(jìn)行全井掃描并計數(shù)。賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲都會發(fā)出明亮的蘋果綠熒光，其中賈第鞭毛蟲為橢圓形(長8～14μm、寬7～10 μm)，隱孢子蟲為略微橢圓的圓形(直徑為2～6 μm)。在紫外光下，DAPI陽性會出現(xiàn)4個亮藍(lán)色的核。

1.4 水樣加標(biāo)回收試驗

分別用Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法對純水、出廠水和水源水進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。每個水樣的體積為20 L，各加入1支質(zhì)控標(biāo)樣ColorSeed，鏡檢計數(shù)并計算回收率。

1.5 免疫磁分離+染色鏡檢階段的加標(biāo)回收試驗

將1支質(zhì)控標(biāo)樣ColorSeed加入側(cè)平面試管內(nèi)，用10 mL純水代替水樣濃縮物，鏡檢計數(shù)并計算免疫磁分離+染色鏡檢階段的回收率、富集濃縮階段的回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣加標(biāo)回收試驗結(jié)果

表1 Envirochek方法和Filta－Max Xpress快速方法對“兩蟲”的回收率

從表1可見，兩種方法的加標(biāo)回收率均達(dá)到國標(biāo)要求(10% ～100%)。此外，無論是純水、出廠水還是水源水，F(xiàn)ilta－Max Xpress快速方法的回收率均高于Envirochek方法。兩者對水源水的加標(biāo)回收率相差最大，這可能是因為富集濃縮的原理不同:Envirochek方法通過褶聚醚砜濾紙濾囊和帶臂水平振蕩器，利用振蕩把“兩蟲”淘洗出來;而Filta－Max Xpress快速方法通過快速濾芯和自動淘洗裝置，后者利用高壓實現(xiàn)對濾芯的反向沖洗，淘洗更充分。

兩種方法的二次酸化操作均可回收到“兩蟲”，因此對磁珠進(jìn)行二次酸化可提高“兩蟲”的加標(biāo)回收率。

2.2 二次淘洗對回收率的影響

對水源水加標(biāo)樣品淘洗后的濾囊和濾芯進(jìn)行二次淘洗，再進(jìn)行免疫磁分離、熒光抗體染色、鏡檢。采用Envirochek方法的濾囊二次淘洗后，可使賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲回收率分別提高8%和10%;Filta－Max Xpress快速方法的濾芯采用二次淘洗后，可使賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲回收率分別提高5%和4%。因此，對濾囊或者濾芯進(jìn)行二次淘洗，均可提高“兩蟲”的加標(biāo)回收率，其中對Envirochek方法回收率的提高效果更明顯。

2.3 免疫磁分離+染色鏡檢階段的回收試驗

從表2可見，“兩蟲”在富集濃縮階段的回收率低于免疫磁分離+染色鏡檢階段的回收率，說明“兩蟲”在富集濃縮階段最難回收。富集濃縮階段包括濾水、淘洗、濃縮多個步驟，濾水步驟可能會發(fā)生“兩蟲”的穿透，淘洗步驟可能存在淘洗不完全的情況，濃縮步驟容易攪動沉淀物，這都會影響“兩蟲”的回收率。因此富集濃縮階段是控制回收率較為關(guān)鍵的一步。

表2 不同階段“兩蟲”的加標(biāo)回收率

2.4 注意事項

2.4.1 過濾階段

控制Envirochek方法的濾速不超過2 L/min，F(xiàn)ilta－Max Xpress快速方法的濾速不超過4 L/min。水樣(特別是加標(biāo)水樣)要在磁力攪拌器上邊攪拌邊過濾;濾器在過濾過程中盡量保持垂直，以有利于“兩蟲”的截留。

2.4.2 淘洗階段

PBST緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用，控制緩沖液pH值在7．4以下，偏堿性時不易洗出“兩蟲”;在緩沖液中加入Tween20，有利于減少原蟲掛壁;對濾囊/濾芯進(jìn)行二次淘洗可提高“兩蟲”回收率。

2.4.3 濃縮階段

離心瓶與適配器一起用十分之一天平配平，保證誤差在0．5 g以內(nèi)，盡量減少離心過程的擺動;離心機(jī)結(jié)束工作后，使樣品自然減速以免擾亂沉淀物，影響濃縮結(jié)果;用虹吸法或移液槍吸走上清液時，虹吸管口/槍頭口要在離心杯中心靠近液面處吸取上清液，以減少沉淀的損失。一般保留10 mL液體，如果沉淀物體積大于0．5 mL，要注意計算需保留液體的體積，然后取10 mL濃縮液進(jìn)行下一步試驗，防止沉淀物過多對“兩蟲”回收率的影響。

2.4.4 捕獲階段

側(cè)平面試管在旋搖時不能裝太滿，以留出空間讓磁珠在旋搖過程中與“兩蟲”充分靠近，提高捕獲率。

2.4.5 免疫磁分離階段

用Buffer A試液清洗側(cè)平壁試管時，注意只清洗有磁珠的平面，不能將液體晃到其他平面，以防磁珠粘附影響回收。酸化步驟得到的鹽酸洗脫液，最好一次性轉(zhuǎn)移至載玻片中，以避免多次轉(zhuǎn)移帶來損耗;轉(zhuǎn)移鹽酸洗脫液時，不能從磁極上取下磁板，轉(zhuǎn)移過程中不碰貼壁的磁珠;鹽酸洗脫液移入載玻片后要輕輕吸混鹽酸和氫氧化鈉，使中和完全;過酸或者過堿都會影響“兩蟲”的染色，因此鹽酸和氫氧化鈉的濃度要精確，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，以保證在載玻片上的液體最后達(dá)到酸堿平衡。

2.4.6 染色階段

載玻片上的樣品干燥可在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，但注意培養(yǎng)箱溫度最好不要超過37℃，干燥時間不超過1 h;Easystain染色如果用到培養(yǎng)箱，需先把濕盒置于培養(yǎng)箱中預(yù)熱15 min;Fixing Buffer洗脫液需要保持冰冷，從冰箱取出后2 min之內(nèi)使用，每次即用即取;Fixing Buffer洗脫液要逐滴緩慢加入，避免溢出中心圓圈。

2.4.7 時間的控制

樣品采集后72 h內(nèi)完成過濾，過濾后的濾芯/濾囊應(yīng)置于0～4℃避光保存;淘洗和制片在24 h內(nèi)完成，從玻片干燥到染色在72 h完成，鏡檢在7 d內(nèi)完成。

3 結(jié)論

由于“兩蟲”會對人體健康產(chǎn)生威脅，為了對其進(jìn)行有效的防范，必須做好水中的檢測工作。與Envirochek方法相比，F(xiàn)ilta－Max Xpress快速方法對“兩蟲”具有更高的加標(biāo)回收率。對濾囊或者濾芯進(jìn)行二次淘洗，在過濾、淘洗、濃縮、捕獲、免疫磁分離、染色階段規(guī)范方法和步驟，并控制好操作時間，均有助于提高“兩蟲”的回收率。