膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵條件及體外抗氧化活性分析

鐘 寶， 李應華， 李鳳林， 劉 超， Youn-Soo Cha

(1.吉林農業(yè)科技學院 食品工程學院, 吉林 吉林 132101； 2.漯河職業(yè)技術學院 食品學院, 河南 漯河 462002； 3.韓國全北國立大學 食品科學與人類營養(yǎng)， 韓國 全羅北道 全州 54896)

膠陀螺〔Bulgariainquinans(Pers.) Fr.〕又名拱嘴蘑、豬嘴蘑，屬子囊菌綱蠟釘菌目膠陀螺科膠鼓菌屬；其子囊盤黑褐色，較小且似陀螺狀、豬咀狀而得名。膠陀螺主要分布于我國的吉林、遼寧和黑龍江等省，夏秋季生于樺樹、柞樹、榆樹的倒木和木樁上，陰雨后大量出現。該菌為藥食兼用真菌，被廣泛用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。其菌絲體含有大量多糖和苯并[j]熒蒽類、Azaphilone 類化合物，具有抗癌、抗菌作用，同時對血淤患者血流流變性可產生影響，如可增強紅細胞變性能力，降低血液粘稠度[1]；其獨特的口感和豐富的營養(yǎng)價值使其近年來深受各國消費者青睞。由于膠陀螺生長季節(jié)性強，且隨著森林環(huán)境日漸惡化，其資源量呈逐年減少趨勢，產量少且不穩(wěn)定，產品質量不能保證，無法滿足商品化、市場化的需求，致使膠陀螺一直得不到有效的開發(fā)和利用。與子實體培養(yǎng)相比，液態(tài)發(fā)酵菌種具有生長周期短、營養(yǎng)價值高及產量大等優(yōu)點[2]。目前，關于膠陀螺的研究主要集中在子實體化學成分分離、鑒定、藥理活性分析及膠陀螺光敏毒性成分鑒定分析等方面，對菌絲體的研究較少。鑒于此，對膠陀螺菌絲體的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件進行篩選，同時對體外抗氧化活性進行分析，以期為膠陀螺菌絲體液態(tài)培養(yǎng)及其作為潛在的抗氧化劑開發(fā)提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1膠陀螺膠陀螺一級菌種，由蛟河市黃松甸鎮(zhèn)食用菌合作社提供。

1.1.2試劑葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母浸膏、花生餅粉、硫酸銨、硝酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、馬鈴薯、瓊脂粉、純水、VB1和VC，均為分析純或化學純。

1.1.3儀器設備SW CJ ZD超凈臺，蘇州凈化儀器有限公司；HVE.50滅菌鍋，日本Hirayama公司；PHS.3C pH計，上?？茖W儀器股份有限公司；TDL.5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-2660紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；TG328A分析天平，上海天平儀器廠；FD-T12N-80冷凍干燥機，上海勝衛(wèi)電子科技有限公司；BS-2F數顯振蕩培養(yǎng)箱，北京金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2方法

1.2.1材料預處理

1) 培養(yǎng)基的制備。馬鈴薯汁2%(馬鈴薯去皮煮沸取汁)，葡萄糖0.25%，瓊脂0.2%，VB10.02%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 1%，水1 000 mL，121℃滅菌30 min備用。

2) 發(fā)酵培養(yǎng)液的制備。碳源4%，氮源0.3%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 1%，VB10.02%，水1 000 mL，121℃滅菌30 min備用。

3) 種子制備及液態(tài)培養(yǎng)。參照文獻[3-5]的方法，選擇菌種生長旺盛的斜面培養(yǎng)基，將其分割成2小塊，其中1塊在無菌條件下接種在100 mL培養(yǎng)液中，在25℃、150 r/min條件下搖床培養(yǎng)7 d，另一塊保存?zhèn)溆?；將培養(yǎng)好的種子液以接種量10%接種至250 mL培養(yǎng)液中，在25℃、150 r/min條件下搖床培養(yǎng)6 d，收集菌絲體，通過計算菌絲體干重(mg)與發(fā)酵液體積(mL)的比例得到菌絲體的生物量。

1.2.2不同因素對膠陀螺菌絲生長的影響

1) 碳源和氮源確定。碳源是菌絲體生長的重要物質基礎，合適的碳源能使菌絲體的生物量增加。氮源是液態(tài)發(fā)酵過程中菌種細胞合成蛋白質、核酸的重要物質。

碳源。設5個處理，即在基礎培養(yǎng)基中分別添加4%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉及玉米粉作為碳源，將膠陀螺菌絲體接種于碳源篩選培養(yǎng)基/液中，3次重復，在25℃、150 r/min條件下搖床培養(yǎng)，接種后每隔24 h測量1次，其測6次，參照文獻[6]的方法計算菌絲生長量。選取菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的碳源為最佳碳源。

氮源。設5個處理，即在基礎培養(yǎng)基中分別添加0.3%的蛋白胨、酵母浸膏、花生餅粉、硫酸銨和硝酸銨作為氮源，將膠陀螺菌絲體接種于氮源篩選培養(yǎng)基/液中，3次重復，在25℃、150 r/min條件下搖床培養(yǎng)，接種后每隔24 h測量1次，共測6次，計算菌絲生長量。選取菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的氮源為最佳氮源。

2) 液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵條件。在上述試驗的基礎上分別對培養(yǎng)基組分最佳碳源(葡萄糖)、氮源(酵母浸膏)、KH2PO4和MgSO4·7H2O的用量進行篩選，通過測定菌絲體生物量及胞外粗多糖含量[7-8]，確定液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的最佳用量。

葡萄糖。設5個處理，即葡萄糖的添加量分別為2%、3%、4%、5%和6%，酵母浸膏添加量為0.3%，KH2PO4添加量為0.5%，MgSO4·7H2O添加量為1.0%。

酵母浸膏。設5個處理，即酵母浸膏的添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，葡萄糖添加量為4%，KH2PO4添加量為0.5%，MgSO4·7H2O添加量為1.0%。

KH2PO4。設5個處理，即KH2PO4的添加量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%，葡萄糖添加量為4%，酵母浸膏添加量為0.3%，MgSO4·7H2O添加量為1.0%。

MgSO4·7H2O。設5個處理，即MgSO4·7H2O的添加量分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%，葡萄糖添加量為4%，酵母浸膏添加量為0.3%，KH2PO4添加量為0.5%。

3) 響應面試驗。選擇葡萄糖(A)、酵母浸膏(B)、KH2PO4(C)和MgSO4·7H2O(D)為主要影響因素，以菌絲體生物量(Y)為響應值，運用Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken設計，對膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并進行響應面分析，篩選最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基條件。試驗因素與水平方案見表1。

表1膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基響應面試驗的因素與水平

Table 1 Factors and levels of response surface test of liquid fermentation medium ofB.inquinansasmycelium %

因素 Factor水平 Level-101葡萄糖(A)Glucose345酵母浸膏(B)Yeast extract0.20.30.4KH2PO4(C)0.30.50.7MgSO4·7H2O(D)0.81.01.2

1.2.3膠陀螺菌絲體的抗氧化活性取100 mL發(fā)酵液，在4℃、6 000 r/min的條件下離心8 min，吸出上清液，收集沉淀，并使用超純水反復洗滌3次后進行真空冷凍干燥，獲得菌絲體，然后將菌絲體分別配置成不同濃度的溶液，放入超聲細胞粉碎機中超聲5 min，在4℃、6 000 r/min的條件下離心5 min，取上清液待用。

1) DPPH自由基的清除能力。DPPH自由基清率(Y1)參照吳林秀等[9-11]的方法并加以改進后測定。取0.5 mL濃度分別為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%及1.3%的待測液，加入0.5 mL DPPH溶液混勻，放在暗室中反應1 h后離心取上清液，在515 nm處測定吸光度(A1)；再取0.5 mL蒸餾水分別與0.5 mL的不同濃度樣品和0.5 mL的DPPH混合在515 nm處測定吸光度(A2、A3)，采用VC作為陽性對照。

2) ABTS自由基的清除能力。ABTS自由基清率(Y2)參照陳旭峰等[12-14]的方法并加以改進后測定。取濃度分別為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%及1.3%的待測液0.5 mL，加入0.5 mL ABTS 溶液，混勻后放在暗室中反應20 min，進行離心取上清液，在732 nm處測定吸光度(B1)。再取0.5 mL蒸餾水分別與0.5 mL的不同濃度的樣品和0.5 mL的ABTS 混合，在732 nm處測定吸光度(B2、B3)，采用VC作為陽性對照。

Y1=[1-(A1-A2)÷A3]×100%

Y2=[1-(B1-B2)÷B3]×100%

2結果與分析

2.1不同碳源和氮源處理膠陀螺菌絲體的生物量

碳源是菌絲體生長的重要物質基礎，合適的碳源能使菌絲體的生物量增加；氮源是液態(tài)發(fā)酵過程中菌種細胞合成蛋白質、核酸的重要物質，對液態(tài)發(fā)酵影響極大。從圖1看出，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉5種碳源對膠陀螺菌絲體生物量的影響差異較為明顯。其中，葡萄糖作為碳源膠陀螺菌絲體的生物量最高，為13.2 g/L；其次是蔗糖，菌絲體的生物量為11.5 g/L。因此，選擇葡萄糖作為發(fā)酵用碳源。蛋白胨、酵母浸膏、花生餅粉、硫酸銨、硝酸銨5種氮源對菌絲體生物量的影響存在一定差異，其中，酵母浸膏作氮源，膠陀螺菌絲體的生物量最高，為14.2 g/L；其次是花生餅粉，菌絲體的生物量為13.3 g/L。因此，選擇酵母浸膏作為最優(yōu)氮源。

圖1不同碳源和氮源處理膠陀螺菌絲體的生物量

2.2不同液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵條件膠陀螺菌絲體的生物量和胞外多糖含量

從圖2看出，隨著葡萄糖、酵母浸膏、KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量的增加，菌絲體生物量呈先增后減趨勢，胞外多糖含量的變化也隨添加量的增加呈先增后減趨勢。葡萄糖添加量為4%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為13.5 g/L和9.45 g/L，其最佳添加量為4%，選擇3%、4%和5%添加量進行后續(xù)試驗。酵母浸膏添加量為0.3%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為14.5 g/L和10.15 g/L，其最佳添加量為0.3%，選擇0.2%、0.3%和0.4%添加量進行后續(xù)試驗。KH2PO4添加量為0.5%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為13.0 g/L和9.1 g/L，其最佳添加量為0.5%，選擇0.3%、0.5%和0.7%添加量進行后續(xù)試驗。MgSO4·7H2O添加量為1%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為13.2 g/L和9.24 g/L，其最佳添加量為1%，選擇0.8%、1%和1.2%添加量進行后續(xù)試驗。

圖2不同液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵條件膠陀螺菌絲體的生物量與胞外多糖含量

2.3膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配方

從表2看出，處理4和處理8膠陀螺菌絲體的生物量最高，均為14.8 g/L；其次是處理14和處理13，分別為14.7 g/L和14.6 g/L；處理18最小，為11.9 g/L。對試驗結果進行多項式擬合回歸得回歸方程為Y=14.60-0.11A-0.19B-0.017C-0.083D-0.30AB+0.000AC+0.43AD-0.17BC+0.25BD+0.23CD-1.09A2-0.64B2-1.30C2-1.00D2，模型P<0.000 1(表3)，表明試驗的二次多項式模擬極顯著，模型的R2= 0.965 1(AdjR2= 0.930 1)，說明，響應值的變化有93.01%來自所選變量；變異系數(CV)為1.81%，模型準確度較高，變異的可能性很小。同時，失擬項P值為極不顯著，說明，該模型擬合程度較好。因此，可利用該模型對膠陀螺菌絲體的液態(tài)培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。該模型中一次項A和二次項A2、B2、C2、D2對菌絲體生物量的影響均為極顯著，一次項B和交互項AB為顯著。各因素對膠陀螺菌絲體生物量的影響依次為A、D、C、B。

表2膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基響應面試驗的設計方案

表3膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基響應面回歸方程的方差分析

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

Note: ** indicates that the difference is extremely significant (P<0.01); * indicates significant difference (P<0.05).

從圖3看出，各響應面均為開口向下的凸形曲面，說明，響應值存在極高值。葡萄糖(A)、酵母浸膏(B)、KH2PO4(C)和MgSO4·7H2O(D)4個因素之間彼此存在交互影響。通過線性回歸方程得出膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配方：葡萄糖添加量為4.6%、酵母浸膏添加量為0.3%、KH2PO4添加量為0.5%和MgSO4·7H2O添加量為1%。此條件下膠陀螺菌絲體的生物量為14.95 g/L。

圖3不同因素交互作用膠陀螺菌絲體的生物量響應面

2.4膠陀螺菌絲體的抗氧化活性

從圖4可知，低濃度的膠陀螺菌絲體對DPPH自由基和ABTS自由基均具備清除能力，且隨著濃度的增加該清除能力呈遞增趨勢。DPPH自由基作為一種抗氧化的反應，在515 nm處的吸光度有特征吸收峰。當菌絲體和VC濃度增至1.3 mg/mL時，對DPPH和ABTS自由基清除率分別為68.25%、78.38%和82.17%、85.78%,VC的清除能力均略高于菌絲體的。

圖4膠陀螺菌絲體對 DPPH和 ABTS自由基的清除率

3結論與討論

研究結果表明，在葡萄糖、酵母浸膏、KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量分別為4.6%、0.3%、0.5%和1%時，膠陀螺菌絲體液態(tài)發(fā)酵的效果最佳，菌絲體生物量為14.95 g/L。膠陀螺菌絲體對DPPH和ABTS自由基均具備清除能力，當其濃度為1.3 mg/mL時，清除率分別達68.25%和78.38%。膠陀螺自然發(fā)酵液中富含多種氨基酸和無機元素，同時含有檸檬酸和酒石酸等物質[15]；膠陀螺子實體含有蛋白質、脂肪和糖等多種營養(yǎng)成分，氨基酸含量達6.84%[16]；膠陀螺子實體對水相對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌均有一定抑制作用[17]；同時，前人對膠陀螺中含有的光敏活性物質進行過相關分析，并提出了相應的處理辦法[18]。在今后研究中應該加強對液態(tài)發(fā)酵物營養(yǎng)成分以及抑菌功效的測定，同時，對液態(tài)發(fā)酵狀況下光敏活性物質進行檢測研究，為后續(xù)的動物試驗及未來相關產品開發(fā)提供安全保障。