基于ISSR標(biāo)記的西南地區(qū)石斛資源親緣關(guān)系分析

賈 元， 胡利娟， 馮 群， 田忠靜， 余 雨， 翁慶北， 朱 斌

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

石斛是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物的統(tǒng)稱，其兼具藥用與觀賞價(jià)值。我國(guó)石斛有74種和2個(gè)變種，分布于秦嶺以南各省區(qū)，尤以云南為多[1]，絕大多數(shù)為野生狀態(tài)。石斛的藥用價(jià)值早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，其具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺明目及滋陰清熱等功效[2]。石斛在自然條件下種子發(fā)芽率低，加上長(zhǎng)期采挖和生態(tài)破壞，其野生資源環(huán)境受?chē)?yán)重破壞而成為瀕危植物，導(dǎo)致市場(chǎng)上石斛類藥材植物緊缺。因此，金石斛屬(Flickingeriaalbopurpurea)等近緣屬植物?；熳魇愃幉氖褂肹3]。

目前，鑒定物種親緣關(guān)系的方法有RAPD[4-5]、AFLP[6-7]、RFLP[8-9]、ISSR[10-11]及DNA條形碼[12-13]等，其中ISSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RAPD和SSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，具有成本低、多態(tài)性高及快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已用于不同石斛的群居遺傳多樣性研究[14]，并取得良好效果。近年來(lái)，為保護(hù)石斛的野生資源及保障市場(chǎng)需求，對(duì)石斛進(jìn)行相應(yīng)的引種栽培及雜交選育使石斛屬植物種質(zhì)資源越來(lái)越復(fù)雜，對(duì)石斛資源親緣關(guān)系進(jìn)行分析，將為石斛的起源、進(jìn)化研究提供理論依據(jù)，也將為野生石斛資源的有效利用及保護(hù)提供理論支撐。鑒于此，結(jié)合前人的研究，采用ISSR標(biāo)記技術(shù)(簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增)運(yùn)用11條引物對(duì)采自西南地區(qū)的24份石斛植物材料進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析，以期為更好地保護(hù)、開(kāi)發(fā)和選育優(yōu)良石斛品種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

石斛：24份石斛分別采自云南、貴州等地，依據(jù)《中國(guó)植物志》完成鑒定，所取材料栽培于貴州師范大學(xué)溫光培養(yǎng)室。試驗(yàn)材料名稱及采集地點(diǎn)詳見(jiàn)表1。

儀器與試劑：ETC811 PCR儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；DYCP-31E型電泳槽，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)K8360，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司；CTAB、Tris-base、EDTA、苯酚、氯仿、異戊醇、鹽酸、無(wú)水乙醇、無(wú)菌去離子水等，貴州凱信生物科技有限公司；2 × Taq MasterMix (Dye)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ISSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1石斛材料名稱及采集地點(diǎn)

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取從實(shí)驗(yàn)室栽培的石斛植株上摘取幼嫩葉片，參考CTAB法[15]加以改進(jìn)提取植物基因組DNA。具體方法：剪取石斛幼嫩葉片0.1 g放在研缽中，加入750 μL 2% CTAB充分研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，65℃水浴1 h(每隔20 min搖勻1次)；取出離心管冷卻到室溫在通風(fēng)櫥里通風(fēng)狀態(tài)下加入750 μL的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，上下顛倒混勻；12 000 r/min離心15 min，取上清液500 μL于新的離心管中，然后向上清中加入-20℃的無(wú)水乙醇1 mL沉淀DNA，-20℃存放20 min；8 000 r/min離心5 min去除上清液，沉淀用75%的乙醇清洗3次，第3次清洗時(shí)不必倒出，放置過(guò)夜，第2天離心倒掉上清液；室溫下晾干或通風(fēng)櫥干燥后加入 200 μL無(wú)菌去離子水溶解后置-20℃保存；取2 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.2.2引物篩選ISSR引物的合成根據(jù)楊立昌等[15-17]公布的引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，通過(guò)用合成的20條引物對(duì)8份石斛植物材料基因組DNA進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)擴(kuò)增，從中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、多態(tài)性較好的引物用于24份石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

1.2.3ISSR-PCR擴(kuò)增參考ISSR反應(yīng)體系[17-18]稍加改進(jìn)：PCR反應(yīng)體積20 μL，包含稀釋過(guò)的DNA模板2.0 μL，MIX 8.0 μL引物(10 μmol/L)1.0 μL，無(wú)菌去離子水9 μL。PCR擴(kuò)增程序參考孔瓊等[17-18]并加以改進(jìn)，具體：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火45 s(退火溫度由引物而定，具體見(jiàn)表2)72℃延伸2 min，共45個(gè)循環(huán)，72℃復(fù)性7 min，4℃保存PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中電泳檢測(cè)。使用Super DNA marker 標(biāo)定擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，在90 V電壓下，電泳1.5 h后置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察、照相，檢測(cè)ISSR-PCR譜帶?？紤]條帶清晰度，因而采用17孔電泳槽梳子加大擴(kuò)增產(chǎn)物劑量，因此下面擴(kuò)增電泳圖譜僅部分呈現(xiàn)。

表2 不同ISSR引物序列及ISSR擴(kuò)增情況

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)拍攝的照片，統(tǒng)計(jì)清晰、穩(wěn)定、可分辨的擴(kuò)增條帶，有帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”，構(gòu)成0/1矩形圖，利用NTSYS 2.10 SHAN程序中的UPGMA(非加權(quán)平均距離法)對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建24份石斛植物的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1供試石斛的擴(kuò)增情況

從石斛的擴(kuò)增電泳圖譜(圖1)看出，11條引物對(duì)24份石斛材料的擴(kuò)增長(zhǎng)度在250～2 000 bp。從表2看出，共檢測(cè)出151個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，平均每條引物擴(kuò)增位點(diǎn)為13.7個(gè)；其中多態(tài)性位點(diǎn)148個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)率為98.01%。24份石斛總擴(kuò)增條帶1 084條，各石斛擴(kuò)增條帶在36～53條，平均45.17條；其中多態(tài)性條帶有1 012條，占比為93.4%。說(shuō)明，供試樣品具有較高的多態(tài)性。

2.2供試石斛的遺傳相似性及親緣關(guān)系

UPGMA法構(gòu)建供試材料的聚類結(jié)果(圖2)顯示，11條引物能將24份石斛分開(kāi)，遺傳相似系數(shù)在0.63～0.78，表明供試樣品具有較近的親緣關(guān)系。在相似系數(shù)0.68處，可將24份石斛材料分為7個(gè)類群。

注：M為marker，1～15分別對(duì)應(yīng)表1中編號(hào)為1～15的石斛材料。

Note: M is a marker, and 1-15 correspond toDendrobiummaterials numbered 1-15 in Table 1, respectively.

圖1引物UBC900和 CTC4Rcb對(duì)石斛的ISSR擴(kuò)增圖譜

Fig.1 ISSR amplification of primers UBC900 and CTC4Rcb onDendrobium

圖224份石斛植物樣品的聚類分析

Ⅰ類包括鐵皮石斛、長(zhǎng)蘇石斛和報(bào)春石斛。Ⅱ類分為A組和B組，A組包括小龜背石斛、澳洲石斛、血喉石斛、櫻石斛、黃喉石斛、具槽石斛、春石斛和獨(dú)角石斛，B組包括重唇石斛、鼓槌石斛、霍山石斛、天宮石斛、尖刀唇石斛和黑毛石斛，其中重唇石斛和鼓槌石斛是24份石斛材料中親緣關(guān)系最近的，遺傳系數(shù)超過(guò)了0.77。Ⅲ類由金石斛屬的金果石斛構(gòu)成，說(shuō)明，金石斛屬與石斛屬存在一定差異。Ⅳ類包括美花石斛和短棒石斛。Ⅴ類包括疊鞘石斛和大苞鞘石斛。Ⅵ類僅有竹葉石斛，Ⅶ類僅有秋石斛，秋石斛與其他23份石斛材料的距離最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)僅為0.63。

3結(jié)論與討論

在傳統(tǒng)分類中，吉占和[19]把我國(guó)石斛屬的74個(gè)種劃分為12個(gè)組，分別是禾葉組、頂葉組、石斛組、心葉組、瘦軸組、叉唇組、距囊組、黑毛組、草葉組、基腫組、劍葉組和圓柱葉組。研究結(jié)果顯示，Ⅰ類的鐵皮石斛、長(zhǎng)蘇石斛和報(bào)春石斛，Ⅳ類的美花石斛和短棒石斛，Ⅴ類的疊鞘石斛和大苞鞘石斛均歸屬石斛組，其各自組為一類群，與傳統(tǒng)的分類一致；但Ⅱ類由2個(gè)組混合在一起聚為同一類，與傳統(tǒng)分類不一致。將Ⅳ類的美花石斛和短棒石斛與盧家仕等[16]對(duì)不同產(chǎn)地石斛屬種質(zhì)資源的ISSR遺傳多樣性分析聚為一類的研究結(jié)果一致，與武榮花[20]的把Ⅰ類的鐵皮石斛、長(zhǎng)蘇石斛和報(bào)春石斛聚為同一類的研究結(jié)果一致，但與朱勝男等[21]的研究有部分不一致。

聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類方法和前人對(duì)部分石斛聚類分析基本一致，但有少數(shù)存在一定的差異，可能與石斛長(zhǎng)期人為或者自然的異花授粉和自然選擇及遺傳背景有關(guān)。某些種之間的形態(tài)特征相差甚遠(yuǎn)，有些石斛種后代有可能形成多種的基因型，根據(jù)形態(tài)學(xué)和地理分布進(jìn)行分類具有一定的局限性，外部的形態(tài)特征受隱性基因、環(huán)境各方面條件的影響，僅從形態(tài)學(xué)和地理分布不能科學(xué)判斷其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。石斛的親緣關(guān)系需要從形態(tài)學(xué)與分子相結(jié)合來(lái)研究，才能得出較為準(zhǔn)確的結(jié)論。DNA分子標(biāo)記不受環(huán)境影響，能直接反應(yīng)基因組DNA間的差異性，能夠在分子水平上對(duì)植物進(jìn)行準(zhǔn)確分類和鑒別。但是石斛的遺傳背景較為復(fù)雜，單一的分子標(biāo)記分析其遺傳多樣性不夠客觀，今后應(yīng)結(jié)合多種標(biāo)記技術(shù)和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對(duì)石斛屬植物進(jìn)行深入研究，對(duì)來(lái)自不同地方的品種及同名異種、同種異名的品種資源進(jìn)行分析，對(duì)石斛進(jìn)行準(zhǔn)確分類和鑒別，進(jìn)而為藥用及觀賞等石斛種質(zhì)資源的合理開(kāi)發(fā)和利用提供更好的借鑒。