甾體類(lèi)藥物的微生物轉(zhuǎn)化制備技術(shù)新進(jìn)展

吳天飛，潘建洪，方從申，陳 凱

（臺(tái)州仙琚藥業(yè)有限公司，浙江 臺(tái)州 317016）

0 前言

生物催化具有高選擇性、環(huán)境友好等特點(diǎn)，是現(xiàn)今可代替及拓寬有機(jī)合成的一個(gè)重要研究領(lǐng)域[1]。全細(xì)胞生物催化法因細(xì)胞自身所具有的輔酶再生系統(tǒng)，其反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需額外添加昂貴的輔因子，且酶在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中具有較強(qiáng)的催化活性，可省去復(fù)雜的胞內(nèi)酶的分離和純化步驟[2-3]。甾體類(lèi)藥物具有很強(qiáng)的抗過(guò)敏、抗感染能力，已成為除抗生素以外的第二大類(lèi)藥物[4]。甾體類(lèi)藥物化學(xué)合成制備存在步驟復(fù)雜、收率低等問(wèn)題，全細(xì)胞生物催化法不僅合成過(guò)程高效、簡(jiǎn)便，并且還能合成一些化學(xué)法所不能合成的甾體中間體[5]，因而全細(xì)胞生物催化技術(shù)廣泛應(yīng)用于甾體類(lèi)藥物的制備研究。生物催化反應(yīng)介質(zhì)與催化性能有著密切的聯(lián)系，在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，底物分子需被運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)，與胞內(nèi)酶進(jìn)行反應(yīng)后再運(yùn)輸出細(xì)胞，其中酶的催化能力與其自身酶活性有關(guān)，而底物的傳質(zhì)速率則取決于轉(zhuǎn)化體系的性能[6]，因此，選擇合適的生物催化反應(yīng)介質(zhì)對(duì)提高微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成目標(biāo)產(chǎn)物的能力至關(guān)重要。

1 水相體系

全細(xì)胞生物催化過(guò)程中，為保證催化體系的穩(wěn)定性，常使用磷酸鹽等緩沖液維持體系pH 及細(xì)胞滲透壓。然而一般甾體類(lèi)物質(zhì)具有很強(qiáng)的疏水性（溶解度范圍：10-5～10-4mol/L），而甾體轉(zhuǎn)化酶屬于胞內(nèi)酶，底物只有擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞才能與酶接觸而進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，這就導(dǎo)致底物與轉(zhuǎn)化酶不能很好接觸，造成轉(zhuǎn)化率偏低，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)[7]。因此，開(kāi)發(fā)適用于甾體類(lèi)化合物微生物轉(zhuǎn)化的新型反應(yīng)介質(zhì)體系受到了人們的重視。

2 雙水相體系

雙水相體系通常指高聚物與高聚物、高聚物與無(wú)機(jī)鹽組成的兩相體系，也包括某些低分子有機(jī)物與無(wú)機(jī)鹽雙水相和表面活性劑雙水相體系。其成相機(jī)理是由于高聚物分子的空間阻礙作用，使得無(wú)法相互滲透形成均一相。雙水相體系中微生物細(xì)胞催化的優(yōu)勢(shì)，在于它可將細(xì)胞限于一相而產(chǎn)物迅速萃取到另一相中，從而可減少產(chǎn)物抑制，或是縮短產(chǎn)物在細(xì)胞附近的停留時(shí)間來(lái)阻止產(chǎn)物的降解[8]。雙水相體系粘度較高，也在一定程度上影響生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中氧傳遞的速率。楊英等[9]采用分枝桿菌Mycobacterium sp.UV-8 轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）（如圖1），考察了高聚物無(wú)機(jī)鹽雙水相系統(tǒng)、高聚物高聚物雙水相系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，研究表明，由不同高聚物組成的雙水相體系都可實(shí)現(xiàn)甾醇的轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化率明顯高于由高聚物與無(wú)機(jī)鹽構(gòu)成的雙水相體系，當(dāng)PEG10000 和DEX2000 濃度分別為12%和8%時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)50%左右。王艷婷等[10]利用分枝桿菌Mycobacterium sp.MB 3683 降解植物甾醇轉(zhuǎn)化AD，在組成為200 g 規(guī)模的聚乙二醇6000（7 wt%）/葡聚糖70000（8 wt%）雙水相體系中，吐溫-40 加量為1%（V/V）、轉(zhuǎn)速為240 r/min的優(yōu)化條件下，豆甾醇投料濃度為10 g/L，轉(zhuǎn)化96 h 后AD 的濃度達(dá)1.1 g/L。

圖1 植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化制備AD

3 雙液相體系和微乳體系

雙液相體系是指由水相與另一不與水相溶的有機(jī)相組成的兩相體系。在生物轉(zhuǎn)化中，該反應(yīng)介質(zhì)通過(guò)底物及產(chǎn)物與細(xì)胞的溶解相不同，從而降低了底物和產(chǎn)物抑制。為增強(qiáng)甾體化合物在反應(yīng)介質(zhì)中的溶解度，通常加入甲醇、氯仿、異丙醇、環(huán)己烷、正庚烷等有機(jī)溶劑作為底物溶解相，但有機(jī)溶劑也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用[11]。因此，一般也會(huì)選擇某些毒性較低的表面活性劑作為增溶劑，如吐溫-80、卵磷脂、植物油等。周配等[12]利用分枝桿菌Mycobacterium sp.NRRLB-3683 轉(zhuǎn)化去氫表雄酮（DHEA，3β-羥基雄甾-5-烯-17-酮），比較了使用大豆油、花生油、玉米油、山茶籽油、葵花油等植物油溶解底物對(duì)生物轉(zhuǎn)化結(jié)果的影響，優(yōu)選出大豆油/水雙相體系作為DHEA 生物轉(zhuǎn)化的最適體系，并采用30 L 發(fā)酵罐進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)中添加30%大豆油和25 g/L底物，轉(zhuǎn)化體系pH=8.0，空氣流量和攪拌速度分別控制在1.0 vvm 和300 r/min，于30 ℃下轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率為96.76%，DHEA 濃度和產(chǎn)率分別為16.33 g/L 和92.65%。徐陽(yáng)光等[13]對(duì)不同甾醇底物對(duì)有機(jī)溶劑和環(huán)糊精及其衍生物的偏好性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，植物甾醇（混合甾醇）最適于作為側(cè)鏈降解的轉(zhuǎn)化底物，且底物甾醇對(duì)不同的增溶劑無(wú)明顯偏好性。以有機(jī)溶劑作為增溶劑時(shí)，乙醇和丙酮在提高產(chǎn)率方面均優(yōu)于其它有機(jī)溶劑；而環(huán)糊精作為增溶劑時(shí)，甲基-β-環(huán)糊精效果最好，當(dāng)投料濃度為15 g/L 時(shí)（環(huán)糊精與底物的質(zhì)量比為2 ∶1），產(chǎn)率仍大于60%。He 等[14]研究了甲苯與Tris-HCl 緩沖液構(gòu)成的雙相體系中添加親水性離子液體[BMIM][Lac]作為共溶劑對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌Arthrobacter simplex UR10611 催化β-羥基甲羥孕酮（HMP）轉(zhuǎn)化為11β，17α-二羥基-6α-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮（PDMDD）的影響，結(jié)果表明，體系中加入2%的[BMIM][Lac]時(shí)，在80 mg HMP 濃度下，反應(yīng)16 h，轉(zhuǎn)化率較未添加離子液體的對(duì)照試驗(yàn)提高了26.8%。

微乳體系是指由水、油、表面活性劑和助表面活性劑（助表面活性劑通常為酚、短鏈醇或其他較弱的兩性化合物）按適當(dāng)比例混合后，形成的具有各向同性、熱力學(xué)穩(wěn)定的透明或半透明分散體系。楊玉芬等[15]采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌Arthrobacter simplex UR016 在Tween-80/乙醇/食用油/水構(gòu)成的微乳體系中考察了11β-羥基甲羥孕酮C1，2的生物脫氫能力，在10 g/L 食用油加量，4 g/L 的Tween-80，7%（V/V）乙醇及4 g/L 底物的濃度下，于33 ℃下轉(zhuǎn)化46 h，脫氫轉(zhuǎn)化率達(dá)88.6%，較水相轉(zhuǎn)化工藝提高了66.2%，取得了較好的轉(zhuǎn)化結(jié)果。

4 含離子液體介質(zhì)體系

離子液體是指在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的、完全由離子（有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子）所組成的鹽，離子液體作為一種新型反應(yīng)介質(zhì)，被譽(yù)為21 世紀(jì)清潔綠色工業(yè)中最理想的反應(yīng)介質(zhì)之一，它具有非揮發(fā)性、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[16]，目前已有將其應(yīng)用于甾體化合物生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究報(bào)道[17]。與其他反應(yīng)介質(zhì)比較，離子液體存在粘度大、價(jià)格較高的問(wèn)題。Shen 等[18]利用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌Arthrobacter simplex CPCC 140451催化轉(zhuǎn)化醋酸可的松（CA）為醋酸強(qiáng)的松（PA）（如圖2）。比較了兩種咪唑啉類(lèi)離子液體對(duì)反應(yīng)的影響情況及相關(guān)機(jī)制的研究，結(jié)果表明離子液體處理后增加了細(xì)胞膜的通透性，使得甾體轉(zhuǎn)化效率得到了提高。Huang 等[19]考察了7 種不同的親水性離子液體和3 種有機(jī)溶劑對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌Arthrobacter simplex UR016 催化17α-羥基-16β-甲基孕甾-4，9（11）-二烯-3，20-二酮（HMPDD）為17α-羥基-16β-甲基孕甾-1，4，9（11）-三烯-3，20-二酮（HMPTD）反應(yīng)性能的影響，盡管大多數(shù)離子液體表現(xiàn)出較有機(jī)溶劑更高的毒性，但在離子液體濃度低于2.5 mmol/L 時(shí)，[EMIM][Lac]或[BMIM][Lac]有助于細(xì)菌生長(zhǎng)，且在[EMIM][Lac]含量為0.3%的最優(yōu)條件下，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了93.4%。Wang 等[20]也考察了咪唑啉類(lèi)離子液體對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌催化CA 時(shí)的影響，研究表明，側(cè)鏈上帶有3個(gè)碳原子的離子液體可增加簡(jiǎn)單節(jié)桿菌對(duì)CA 轉(zhuǎn)化率、溶解度和細(xì)胞膜透性，普遍抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和活性，其中[PF6]-陰離子的ILs 抑制活性最強(qiáng)。袁俊杰[21]考察了合成的16 種水溶性離子液體對(duì)植物甾醇的溶解能力，結(jié)果表明，植物甾醇在12 種四丁基磷／銨脂肪酸鹽離子液體中的溶解度可達(dá)176～565 g/L，是離子液體[BMIM][BF4]（0.1 g/L）和[BMIM][Lac]（0.4 g/L）的1000 倍，較甲醇中提高了100 倍，比乙醇中也提高了10 倍左右。

圖2 簡(jiǎn)單節(jié)桿菌（ASP）轉(zhuǎn)化醋酸可的松（CA）為醋酸強(qiáng)的松（PA）的反應(yīng)過(guò)程

5 含低共熔溶劑體系

低共熔溶劑是指由氫鍵受體（如季銨鹽）和氫鍵供體（如酰胺、羧酸和多元醇等化合物）在一定比例下組合而成的兩組分或三組分低共熔混合物。低共熔溶劑的物理化學(xué)性質(zhì)與離子液體非常相似，因此也有人把它歸為一類(lèi)新型離子液體或離子液體類(lèi)似物。天然低共熔溶劑因其易制備、無(wú)毒、易降解等特點(diǎn)，已被作為一種新型“綠色”介質(zhì)引入生物催化中[22]。Mao 等[23]研究了3 種低共熔溶劑在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌Arthrobacter simplex TCCC 11037 催化CA 反應(yīng)中的作用，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中添加6%的醋酸膽堿/尿素，在5 g/L 的底物濃度下，產(chǎn)率可達(dá)93%，與不添加低共熔溶劑的對(duì)照試驗(yàn)相比，產(chǎn)率提高了25%。

6 結(jié)論與展望

甾體類(lèi)藥物在臨床上具有重要的藥理活性，市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。在生物催化制備甾類(lèi)藥物過(guò)程中，提高其底物溶解度一直是其制備研究的一項(xiàng)難題。利用介質(zhì)工程構(gòu)建不同的生物轉(zhuǎn)化介質(zhì)體系，可很好地解決底物疏水性的問(wèn)題，其中兩相體系能進(jìn)一步降低底物和產(chǎn)物抑制，對(duì)提高底物濃度有著重要的作用?，F(xiàn)今，離子液體與天然低共熔溶劑等具有綠色環(huán)保優(yōu)勢(shì)的反應(yīng)介質(zhì)已被應(yīng)用于甾體類(lèi)藥物的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，為構(gòu)建新型綠色高效的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系提供了新途徑，為甾體藥物的制備工藝提供了新的選擇。