奶牛乳房炎抗生素替代療法的研究進(jìn)展

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

1 抗生素的含義

抗細(xì)菌藥（antibacterial）也稱為“抗細(xì)菌劑”，是一類用于抑制細(xì)菌生長或殺死細(xì)菌的藥物[1]?？股兀╝ntibiotic）是抗細(xì)菌藥的一種?？股厥怯晌⑸铮ò?xì)菌、真菌、放線菌屬）所產(chǎn)生的具有抑制其他類微生物生長、生存的一類次級代謝產(chǎn)物，以及用化學(xué)方法合成或半合成的類似化合物，包括抗細(xì)菌抗生素、抗真菌抗生素以及對付其他微小病原之抗生素，但臨床上，抗生素常常是指抗細(xì)菌抗生素?？股氐母弊饔弥皇鞘鼓c道正常菌群失調(diào)[2]。

2 抗生素的耐藥性

1928年，青霉素的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志抗生素研究進(jìn)入一個(gè)飛速發(fā)展的時(shí)代?？股氐陌l(fā)現(xiàn)和應(yīng)用不但為人類衛(wèi)生事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)，也為畜牧業(yè)帶來了一場革命。然而，我們正面臨失去他們的危險(xiǎn)。青霉素的發(fā)現(xiàn)者弗萊明（Fleming）早在1945年的諾貝爾獎(jiǎng)演說中就警告，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)可能削弱新發(fā)現(xiàn)的青霉素的功效[3]。70年后的現(xiàn)在，弗萊明的警告被證實(shí)是有先見之明的：可控制的感染由于耐藥性的出現(xiàn)而變得難以掌控?；诂F(xiàn)在的研究證明，細(xì)菌可以收集許多遺傳因素，從而賦予對多種抗生素的高水平的耐藥性，進(jìn)而產(chǎn)生多藥耐藥（MDR, multidrug resistance）表型[4]。矛盾的是，盡管臨床需求不斷增長，但曾經(jīng)是傳染病研究和開發(fā)的最前沿的制藥業(yè)卻在很大程度上放棄了抗生素，將精力投入到慢性疾病治療藥物的研究上，因?yàn)檫@些藥物具有更有利的投資回報(bào)前景，例如治療糖尿病和心血管疾病的藥物[3]。這樣的局面會(huì)導(dǎo)致抗生素與其他藥物的革新差距不斷擴(kuò)大，如果得不到解決，我們可能會(huì)回到抗生素時(shí)代之前的狀況，使一些患者只能屈服于曾經(jīng)可治療的病原體面前，而得不到有效的治療，抗生素耐藥性的出現(xiàn)使我們處于嚴(yán)重的環(huán)境中。

3 動(dòng)物飼料中抗生素的禁用

許多類型的人為活動(dòng)，包括農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素使用、抗生素的非人類應(yīng)用以及廢物的處置，都產(chǎn)生了重要的抗藥性環(huán)境儲(chǔ)備以及很可能會(huì)產(chǎn)生毒力基因和具有庇護(hù)能力的生物[5]。自1960年以來，全球牲畜產(chǎn)量大幅增加，這是世界人口增長和對糧食需求增加的直接結(jié)果。1950年美國食品與藥品管理局（FDA）首次批準(zhǔn)抗生素作為飼料添加劑，1994年我國農(nóng)業(yè)部首次發(fā)布了《飼料藥物添加劑允許使用品種名錄》將抗生素列為飼料添加劑。在動(dòng)物飼料中大量添加抗生素生長促進(jìn)劑（AGP, antibiotic growth promoters）促進(jìn)了牲畜生產(chǎn)的增加[6]。但是，自抗生素首次應(yīng)用在飼料養(yǎng)殖業(yè)，對于其副作用的研究就從未停止。關(guān)于AGP及其在多藥耐藥微生物的出現(xiàn)中的作用，引起了全球的關(guān)注。AGP的過度使用已導(dǎo)致動(dòng)物微生物群中產(chǎn)生抗生素抗性，并有可能將抗生素抗性基因從動(dòng)物轉(zhuǎn)移至人類微生物群[6]。出于這種擔(dān)憂，許多國家禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素，瑞典于1986年率先禁止使用AGP[7]。丹麥隨后于1998年禁止使用AGP[7]。但是禁止在動(dòng)物飼料中亞治療劑量使用抗生素會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)量下降[8]，主要原因是牲畜的感染率較高，同時(shí)也增加了消費(fèi)者食源性感染的風(fēng)險(xiǎn)[9]。為了解決禁止AGP在畜牧生產(chǎn)中使用的相關(guān)問題，研究者們已經(jīng)提出了許多抗生素替代品[8]。

2012年9 月于巴黎舉行的世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）首屆“抗生素替代品”（ATA）研討會(huì)上，重點(diǎn)介紹了有希望的研究結(jié)果和新穎的技術(shù)，這些技術(shù)可能會(huì)替代常規(guī)抗生素。會(huì)上評估了它們的商業(yè)化價(jià)值，并提供了支持新抗生素開發(fā)的可行策略[10]。隨后，于2016年12月舉行了第二次抗生素替代品專題討論會(huì)，重點(diǎn)討論了最新的科學(xué)突破或技術(shù)，這些創(chuàng)新型技術(shù)可為預(yù)防和治療動(dòng)物疾病提供選擇和替代策略[11]。中國作為養(yǎng)殖大國，必然也將“禁抗”實(shí)施到底，先是在2017年6月22日，農(nóng)業(yè)部印發(fā)了《全國遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃（2017—2020年）》，該行動(dòng)提出，推進(jìn)獸用抗生素物減量化使用，實(shí)施“退出行動(dòng)”，推動(dòng)促生長抗菌藥物逐步退出。如今，自2020年7月1日起，據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料，具有替抗作用的功能性飼料添加劑需求有望爆發(fā)，可見“替抗”添加劑和藥物的研發(fā)任務(wù)任重道遠(yuǎn)。

4 奶牛乳房炎的抗生素替代療法

奶牛乳房炎(bovine mastitis)一般是由傳染性或環(huán)境性致病菌侵入乳腺造成的感染，其造成的經(jīng)濟(jì)損失通常發(fā)生在患有亞臨床和臨床疾病的奶牛身上。有統(tǒng)計(jì)顯示，由于隱性乳房炎造成的乳制品行業(yè)生產(chǎn)損失每年高達(dá)10億美元[12]。奶牛乳房炎是奶牛最常見的和代價(jià)最高昂的疾病之一，可導(dǎo)致乳產(chǎn)量的減少、獸醫(yī)護(hù)理成本的升高、抗生素殘留的風(fēng)險(xiǎn)以及淘汰或撲殺的損失[13]。乳房炎是大多數(shù)奶牛場及其獸醫(yī)尤其關(guān)注的問題之一，但奶農(nóng)和獸醫(yī)普遍缺乏專業(yè)的培訓(xùn)，且在治療乳房炎方面對抗生素和激素存在依賴[14]。乳腺感染最常見的傳染性細(xì)菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），而母牛周圍的環(huán)境是環(huán)境病原體的主要來源，例如乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和克雷伯菌（Klebsiella spp.）[15]。

奶牛乳房炎的治療通常使用抗生素，包括在干奶期的治療和預(yù)防。吡美霉、甲氧西林、氯西林、阿莫西林、新霉素、青霉素G、二氫鏈霉素、頭孢氨芐和紅霉素均被批準(zhǔn)用于治療和預(yù)防牛乳房炎[16]。然而使用抗生素治療奶牛乳房炎的一個(gè)主要缺點(diǎn)是：由于牛奶中的抗生素殘留，必須存在一定時(shí)間的休藥期而造成一定的牛奶損失。另外，由于抗生素的濫用而引起的抗生素耐藥性的出現(xiàn)已成為關(guān)鍵問題（WHO, 2018）[17]。這些問題促使人們尋找可以用于對抗奶牛乳房炎病原體的新型抗菌劑或抗生素替代物。本文主要概述奶牛乳房炎的幾類抗生素替代物：益生菌、細(xì)菌素、噬菌體、溶菌酶、酸化劑、植物提取物和順勢療法。

4.1 益生菌（Probiotics）

當(dāng)給予足量時(shí)，益生菌是對宿主健康有益的微生物[18]。益生菌可以通過對抗病原體的拮抗活性和免疫調(diào)節(jié)來控制炎癥過程[19]。Bouchard等在2013年體外測試了三種干酪乳桿菌菌株（CIRM-BIA667，BL23，CIRM-BIA1542）預(yù)防金黃色葡萄球菌牛菌株（RF122,Newbould305）入侵牛乳腺上皮細(xì)胞（bMEC）的能力，其中干酪乳桿菌CIRM-BIA1542 是從奶牛乳頭管分離，而其余兩株干酪乳桿菌以其益生菌特性而聞名。Bouchard等人證明干酪乳桿菌CIRM-BIA667以菌株依賴性方式影響金黃色葡萄球菌RF122和Newbould305（分別可誘導(dǎo)急性和中度乳房炎）的黏附和/或內(nèi)化；干酪乳桿菌CIRM-BIA667還可在不影響bMEC形態(tài)和生存力的情況下發(fā)生保護(hù)作用，將兩株金黃色葡萄球菌的內(nèi)化降低60%～80%，一旦內(nèi)化，金黃色葡萄球菌的命運(yùn)就不會(huì)受到干酪乳桿菌的影響；而熱滅活的干酪乳桿菌仍可維持金黃色葡萄球菌的黏附，防止金黃色葡萄球菌內(nèi)化，對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制。該方法為乳房炎主要病原體的新型控制策略提供了新途徑[20]。隨后，Assis等人同樣在2015年證明乳酸乳球菌（V7）可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)入牛乳腺上皮細(xì)胞的內(nèi)在化；當(dāng)檢測乳腺上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)時(shí)，乳酸乳球菌V7能夠誘導(dǎo)其中趨化因子CXCL8輕度增加，并當(dāng)受到大腸桿菌攻擊時(shí)，乳酸乳球菌V7可增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此表明，該類益生菌（乳酸乳球菌和干酪乳桿菌）均可用于預(yù)防奶牛乳房炎[21]。

4.2 細(xì)菌素（Bacteriocins）

細(xì)菌素是細(xì)菌核糖體合成的抗菌肽，對包括抗生素抗性菌株在內(nèi)的其他細(xì)菌具有活性[22]。細(xì)菌素被認(rèn)為是潛在的抗生素替代品，由于其基因編碼可以進(jìn)行操縱，故可以進(jìn)行新穎的藥物設(shè)計(jì)[23]。細(xì)菌素可以單獨(dú)使用，也可以與其他已知的抗生素聯(lián)合使用，以靶向?qū)辜?xì)菌的生物膜[24]。Ceotto-Vigoder等人在2016年測試了乳酸鏈球菌素（Nisin）和溶葡萄球菌素（lysostaphin）兩種細(xì)菌素體外對抗金黃色葡萄球菌形成的生物膜的效果。結(jié)果表明，用溶葡萄球菌素進(jìn)行4h的治療會(huì)導(dǎo)致生物膜的分離和固著細(xì)胞的死亡，而乳酸鏈球菌素的處理只會(huì)降低細(xì)胞的活力。溶葡萄球菌素和乳酸鏈球菌素同時(shí)使用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致固著細(xì)胞大量死亡。溶葡萄球菌素與乳酸鏈球菌素聯(lián)用可為控制牛葡萄球菌性乳腺炎提供另一種解決方案[25]。

4.3 噬菌體（Bacteriophage）

奶牛乳房炎的另一種替代療法是噬菌體療法。噬菌體由含有核酸的頭部、尾部和帶有刺的底板組成，是可以感染并可以通過細(xì)胞裂解殺死細(xì)菌細(xì)胞的病毒。噬菌體和噬菌體來源的內(nèi)溶酶在奶牛乳房炎體內(nèi)和體外模型中多次被評價(jià)，其能夠在體外有效感染并殺死主要的乳房炎致病菌，如金黃色葡萄球菌，包括耐甲氧西林菌株[26]。

當(dāng)噬菌體裂解，細(xì)菌細(xì)胞被感染后，它會(huì)在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，然后子代噬菌體在細(xì)胞裂解后被釋放，并繼續(xù)感染其他細(xì)胞。噬菌體的抑制譜通常是菌株特異性的，噬菌體療法在全球某些地區(qū)已經(jīng)開始使用，主要用以治療人類細(xì)菌感染，由于抗生素耐藥性的提高，它再次引起了人們的關(guān)注[27]，并作為治療和預(yù)防奶牛乳房炎的新型潛在抗菌藥。

4.4 溶菌酶（Bacteriophage endolysins）

溶菌酶可以特異性降解宿主細(xì)胞壁的肽聚糖，從而裂解細(xì)菌，可作為抗革蘭氏陽性菌的潛在抗菌劑。Donovan等人成功分離并純化金黃色葡萄球菌噬菌體phi11溶菌酶，其具有兩個(gè)肽聚糖水解酶結(jié)構(gòu)域（內(nèi)肽酶和酰胺酶）和一個(gè)SH3b細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該溶菌酶完全可以在牛乳環(huán)境中使用。目前已鑒定出全長為481個(gè)氨基酸的金黃色葡萄球菌溶菌酶phi11，其抗菌性在pH6.7和游離鈣濃度（3mM）下均具有活性，而此環(huán)境與牛奶一致。該純化的溶菌酶蛋白可以溶解金黃色葡萄球菌和6種凝固酶陰性葡萄球菌，使其成為強(qiáng)有力的候選蛋白抗菌劑[28]。

4.5 酸化劑（Acidifiers）

酸化劑包括有機(jī)酸和無機(jī)酸，不同種類的酸化劑抗菌功能亦不同。其主要功能是提高生長性能、加快消化進(jìn)程，增加胰蛋白酶的分泌從而抵抗有害菌，增加有益菌。而抗菌機(jī)理主要集中于滲透殺菌、透化細(xì)胞膜、降低環(huán)境pH值三方面。?；撬崾且环N重要的酸化劑，Zheng等人用?；撬嵋种婆R床型奶牛乳房炎患牛乳中分離的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌取得了顯著效果。?；撬崾谴蠖鄶?shù)動(dòng)物組織中含量最豐富的游離氨基酸，它及其衍生物在先天免疫應(yīng)答中具有關(guān)鍵作用，可將其用于治療各種局部感染和慢性炎癥疾病；在與乳腺上皮細(xì)胞互作過程中，?；撬峥梢种拼竽c桿菌、金黃色葡萄球菌TLR2、TLR4上調(diào)，顯著抑制金黃色葡萄球菌iNOS上調(diào)，并下調(diào)促炎因子（如TNF-α），上調(diào)抗炎因子（如IL-10）、趨化因子（如Eotaxin），使TLR活化介導(dǎo)的一些重要因素（如MyD88）均被抑制；TAK-242還可抑制ROS和NAGase活性。因此，?；撬峥梢哉{(diào)節(jié)大腸桿菌感染時(shí)的炎癥反應(yīng)，通過影響TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路和提高細(xì)胞抗氧化能力來防止細(xì)胞損傷，其抗氧化能力也是抵抗金黃色葡萄球菌感染所引起炎癥的主要手段[29]。

4.6 植物提取物（Plant extract）

植物及植物的主要提取物也是如今的抗生素替代療法的研究熱點(diǎn)之一。中國知網(wǎng)上目前與利用中草藥提取物治療奶牛乳房炎相關(guān)的博士論文共有16篇，主要集中于具有抗菌、消炎、抗腫、鎮(zhèn)痛等功能的單體提取物如甘草總黃酮[30]和復(fù)方提取物如苦參堿類生物堿傳遞體凝膠劑[31]。中草藥含有大量的生物堿、鞣質(zhì)、多糖、揮發(fā)油、皂甙以及有機(jī)酸類等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、直接作用病原微生物、修復(fù)受損組織器官等功效，而且中草藥還具有低毒、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，所以在治療細(xì)菌生物被膜疾病方面具有廣闊的前景。早在1997年，Hu等人就使用魚腥草素硫酸氫鈉（HSB），由硫酸氫鈉與魚腥草素反應(yīng)形成的產(chǎn)物，進(jìn)行乳房內(nèi)治療，并且成效顯著。不論是臨床還是微生物治愈率，對急性和亞急性乳房炎的治療與青霉素G聯(lián)合1g鏈霉素（PS）效果幾乎相同；PS在48h內(nèi)對乳酸鏈球菌有抑制作用，但是對于HSB，在處理12h內(nèi)對牛奶中的乳酸鏈球菌有輕微的抑制作用[32]。

此外，在反芻動(dòng)物日糧中，葉子是大多數(shù)天然草場不可或缺的組成部分，化學(xué)研究表明，諸如丹寧酸之類的葉子成分具有沉淀蛋白質(zhì)、抗微生物作用。Min等人在2008年用八種來自美國俄克拉荷馬州的不同木本植物中純化的縮合單寧處理三種致病菌（大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌），研究其對細(xì)菌體外生長的抑制作用。結(jié)果表明，單寧提取物時(shí)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長有抑制作用，并呈劑量依賴性和敏感性；8mg/mL的新橡木（Shinnery oak）和星毛櫟（Post oak）的提取物高度抑制金黃色葡萄球菌；50mg/mL漆樹（Sumac）、鐵掃帚草（Sericea lespedeza），李子樹（Plum）、山茱萸（Skunk bush）單寧提取物對肺炎克雷伯菌無效，而100mg/mL 漆樹的單寧提取物對肺炎克雷伯菌則有比青霉素更好的抑制作用[33]。說明來源和濃度是影響單寧酸抗菌活性的重要因素。植物單寧提取物對選定的病原體具有高度抑制作用，可以作為常規(guī)抗菌飼料添加劑的替代品和補(bǔ)品。

4.7 順勢療法（Homeopathy）

順勢療法是替代療法的一種。順勢醫(yī)學(xué)藥物對治療母牛的乳腺炎能產(chǎn)生良好的療效，這不僅可迅速提高母牛的健康，還可避免牛奶因使用抗菌素治療而被污染，從而保證牛奶的質(zhì)量與生產(chǎn)量。Schultz的一項(xiàng)觀察性試驗(yàn)表明Dolisovet?可提高產(chǎn)奶量并降低牛奶的體細(xì)胞數(shù)。Dolisovet?是一種順勢療法藥物，主要成分為顛茄制劑、紫雛菊、金盞花和白英，已在法國獲得許可，并以10g管軟膏乳房給藥，可用于奶牛體內(nèi)乳腺功能的恢復(fù)。該研究涉及收集和分析來自31個(gè)被自動(dòng)擠奶系統(tǒng)（AMS）感染的乳房區(qū)域的數(shù)據(jù)，以評估Dolisovet?對所選乳腺炎癥參數(shù)的影響。當(dāng)牛奶質(zhì)量開始下降時(shí)，通過AMS發(fā)出的警報(bào)，根據(jù)電導(dǎo)率（EC）可識(shí)別出乳房炎。從AMS警告開始之日起，連續(xù)兩天每天2次給予Dolisovet?。第一次治療后4～7d觀察到EC明顯降低，牛奶產(chǎn)量也增加了。因此，Dolisovet?在乳腺炎癥的早期階段以及恢復(fù)乳腺健康和功能方面可能具有有益的治療作用。這種藥物可能是亞臨床牛乳腺炎的有效一線治療藥物，通過對其的應(yīng)用可以減少對抗生素的需求[34]。

5 未來展望

本文主要綜述了7類潛在治療奶牛乳房炎的抗生素替代物的治療依據(jù)。益生菌已經(jīng)用于畜牧業(yè)，被證明可以提高動(dòng)物的生長速度、產(chǎn)量和總體健康[35]。因此，在農(nóng)場運(yùn)用益生菌進(jìn)行乳房炎的控制容易被接受和推廣。其他抗生素替代物雖目前在臨床上運(yùn)用有限，但均可以被認(rèn)為是具有潛力的抗生素替代品。在未來，不僅要專注于針對乳房炎病原體的抗生素替代物的發(fā)掘，同時(shí)要著重于確定確切的作用方式和傳遞方式，以確保積極應(yīng)對全球抗生素危機(jī)。