腸道菌群對(duì)骨質(zhì)疏松的影響機(jī)制及治療的研究進(jìn)展

謝 輝，林上陽(yáng)，夏晨潔，吳 麗，陳志鵬，李偉東

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 2.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 3.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

腸道具有人體最大的細(xì)菌群落，每個(gè)人都攜帶多達(dá)數(shù)百種的腸道細(xì)菌。微生物群給予宿主包括維生素的生產(chǎn)，從飲食中提取營(yíng)養(yǎng)和能量，代謝功能，先天和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)，以及對(duì)病原微生物的保護(hù)。微生物組的改變與人類(lèi)的一些慢性疾病有關(guān)，包括炎癥性腸病、肥胖癥、代謝性疾病、營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥和心血管疾病[1]。

中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)2018年調(diào)查顯示，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為中國(guó)中老年人群的重要健康問(wèn)題，中老年女性骨質(zhì)疏松問(wèn)題尤為嚴(yán)重。50歲以上女性骨質(zhì)疏松癥患病率為32.1%,65歲以上女性的骨質(zhì)疏松癥患病率更是達(dá)到51.6%。在不經(jīng)意間影響著人類(lèi)的健康，多見(jiàn)于疼痛、駝背。更嚴(yán)重的是，在日常運(yùn)動(dòng)中，家務(wù)過(guò)程中，即使沒(méi)有明顯較大的外力作用，不經(jīng)意間便可發(fā)生骨折，多發(fā)生于胸、腰椎椎體、橈骨遠(yuǎn)端及股骨上端，阻礙人們的日常生活，降低人民生活幸福感。除此之外，骨質(zhì)疏松引發(fā)的胸、腰椎壓縮性骨折會(huì)降低呼吸功能，出現(xiàn)呼吸困難等情況。目前針對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療藥物主要包括雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、激素替代劑和降鈣素等，臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些藥物均有較好的臨床療效。但部分藥物的潛在并發(fā)癥及副作用也隨之突顯[2]。而對(duì)于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松研究較少，所以亟需尋找到新的靶點(diǎn)，開(kāi)辟一條安全有效的途徑，治療多種因素引起的骨質(zhì)疏松癥。

腸道微生態(tài)與骨代謝的相關(guān)性是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病相關(guān)[3]，腸道中的微生物可能通過(guò)自身代謝產(chǎn)物、影響宿主代謝、調(diào)節(jié)腸道屏障功能以及免疫系統(tǒng)、轉(zhuǎn)化藥物代謝等途徑影響骨質(zhì)疏松。本文將通過(guò)由腸道菌群介導(dǎo)的諸多途徑闡述腸道菌群影響骨質(zhì)疏松的機(jī)制，并對(duì)靶向腸道治療骨質(zhì)疏松的藥物進(jìn)行綜述。

1 腸道微生物影響骨質(zhì)疏松癥機(jī)制

1.1 腸道菌群自身代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)是腸道菌群的代謝產(chǎn)物，由羧酸和小烴鏈組成。其中，乙酸、丙酸和丁酸的研究最多，其化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為 2 、3 、 4 個(gè)碳。Lucas等[4]通過(guò)對(duì)小鼠喂SCFA丙酸酯 (C3) 和丁酸酯 (C4),使體內(nèi)的SCFAs含量增加，測(cè)得小鼠的骨含量顯著增加，由此可以表明 SCFAs 含量對(duì)于骨量的保護(hù)有一定的作用。而從機(jī)制上說(shuō)，一方面，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨吸收標(biāo)志物血清水平顯著降低，另一方面，體外實(shí)驗(yàn)表明, C3 和 C4 顯著抑制了兩個(gè)必需的破骨細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分 TRAF6 和 NFATc1，這些實(shí)驗(yàn)從不同角度有力的表明與骨吸收的抑制有關(guān)，SCFAs 對(duì)骨形成也有一定的影響。Tyagi 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽能夠增加調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg) 在腸道和骨髓中的數(shù)目，而 Treg 細(xì)胞能夠刺激CD8+T細(xì)胞分泌 Wnt 配體Wnt10b,從而通過(guò)激活成骨細(xì)胞中的 Wnt 信號(hào)刺激骨形成。間充質(zhì)干細(xì)胞(NSCs)具有成骨和成脂的能力， Chen 等[6]研究表明，MSCs當(dāng)被誘導(dǎo)進(jìn)行成骨分化時(shí)，丁酸鈉能夠刺激成骨分化并上調(diào) Runx2 和 Runx2 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，也能夠通過(guò)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞分化。

除了通過(guò)直接干預(yù)破骨細(xì)胞分化及骨形成等，SCFAs還可以影響礦物質(zhì)的吸收。試驗(yàn)結(jié)果表明，SCFAs可通過(guò)調(diào)節(jié)礦物質(zhì)離子與氫離子之間的電解質(zhì)交換，直接影響腸道對(duì)礦物質(zhì)的吸收，促進(jìn)上皮細(xì)胞對(duì)礦物質(zhì)離子的吸收[7]。SCFAs 可以降低腸腔內(nèi)的pH值，增加鈣在大鼠結(jié)腸段的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)鈣的吸收。在牛中，丁酸可以激活中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)鈣離子(Ca2+)內(nèi)流和絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，丙酸鹽會(huì)增加中性粒細(xì)胞 Ca2+內(nèi)流[8]。綜上所述，腸道菌代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸能夠有效的干預(yù)骨質(zhì)疏松癥，為骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防與治療提供新手段。

1.2 宿主-微生物群共代謝腸道微生物群的組成和活動(dòng)自出生起就與宿主共同發(fā)育，并受到宿主基因組、營(yíng)養(yǎng)和生活方式之間復(fù)雜的相互作用影響。越來(lái)越多研究表明，腸道微生物群通過(guò)一系列相互作用的宿主-微生物群代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫炎性軸，參與調(diào)節(jié)多種哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑，這些軸在生理學(xué)上連接腸道、肝臟、大腦和其他器官[9]。

Xing等[10]分析慢性深度缺氧條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與腸道菌群的關(guān)系。成骨細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，成骨細(xì)胞的成骨作用不能夠平衡破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，導(dǎo)致骨量降低是骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制之一。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性深度缺氧導(dǎo)致腸道微生物群落多樣性發(fā)生改變，乳酸菌顯著減少，降解 D-半乳糖的酶減少，使D-半乳糖累積，而累積的D-半乳糖使血液和骨髓中能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)早衰老的活性氧積累。

要研究腸道菌群和宿主之間的這一復(fù)雜的代謝體系，代謝組學(xué)是目前較為有效的研究手段。Xu 等[11]采用非靶向代謝組學(xué)策略，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等代謝途徑是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠代謝功能改變最多的途徑。大多數(shù)代謝途徑與糖代謝、分子轉(zhuǎn)運(yùn)和脂質(zhì)有關(guān)。龍維富等[12]研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的血漿代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較,去卵巢組大鼠代謝產(chǎn)物乳酸、丙酮和乙醇水平升高,而膽堿/磷脂酰膽堿、丙氨酸、 VLDL/LDL 、 HDL/LDL 、血糖及脂肪酸水平降低。如核糖體，糖酵解，氨基酸生物合成，碳代謝，和氧化磷酸化，已被證明調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化，影響骨形成。鄭曉皎[13]通過(guò)對(duì)抗生素干擾實(shí)驗(yàn)，利用 UPLC/QTOFMS 和 GC/TOFMS 色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了腸道菌群-宿主代謝物組的全譜和靶標(biāo)分析平臺(tái)。其中，色氨酸代謝途徑、酪氨酸、苯丙氨酸代謝途徑、腦-腸軸、短鏈脂肪酸和糖類(lèi)物質(zhì)、中長(zhǎng)鏈脂肪酸和膽酸類(lèi)物質(zhì)等以及代謝的改善與腸道微生物群的改變密切相關(guān)[14]。綜上所述，骨質(zhì)疏松癥的治療與宿主代謝有著密不可分的關(guān)系，而腸道菌群又影響著一些宿主代謝，形成腸道菌-宿主共代謝。但是關(guān)于這方面的靶向性來(lái)影響骨質(zhì)疏松的機(jī)制研究的還不夠深入，還需要進(jìn)一步深入研究，也為骨質(zhì)疏松的預(yù)防與治療提供了新思路，具有社會(huì)價(jià)值。

1.3 腸道屏障與免疫腸道屏障在維持宿主體內(nèi)平衡中起重要作用。腸上皮由連續(xù)的單層腸上皮細(xì)胞組成，其通過(guò)緊密連接(TJ)蛋白密封在一起。TJs是由Claudins蛋白、Occludin蛋白和Zo蛋白組成的一種蛋白質(zhì)復(fù)合物,決定了細(xì)胞外溶質(zhì)的滲透性。腸上皮被一層粘液覆蓋，由粘蛋白組成，形成物理屏障。該屏障阻止了微生物與上皮表面的相互作用，抑制細(xì)菌粘附到腸上皮細(xì)胞，限制免疫反應(yīng)和維持屏障功能。腸道微生物群的生態(tài)失調(diào)，使具有降解粘蛋白能力的細(xì)菌豐度增加，影響粘蛋白產(chǎn)生[15]。粘蛋白的減少，使細(xì)菌更多黏附到腸上皮細(xì)胞，使腸上皮細(xì)胞上的模式識(shí)別受體發(fā)出信號(hào)，激活 NF-κB 通路。上皮細(xì)胞 NF-κB 活化增加促炎細(xì)胞因子，如 TNF-α、IL-1和INF-γ等。幾種細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)TJ復(fù)合物，TJ連接其頂端側(cè)的相鄰上皮細(xì)胞，TJ蛋白復(fù)合物由連接粘附分子、occludins、橋粒、密蛋白和細(xì)胞骨架連接蛋白組成，提供粘合力以確保上皮層的完整性。TNF-α增加肌球蛋白輕鏈激酶的表達(dá)，IFN-γ降低ZO-1蛋白合成，增加TJ蛋白的內(nèi)化并重新排列肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。使得上皮層完整性被破壞，腸道通透性增加[16]。腸道通透性增加，導(dǎo)致腸道菌群中的有害菌以及產(chǎn)生的影響骨質(zhì)疏松的有害代謝物可以進(jìn)入機(jī)體，進(jìn)一步引發(fā)免疫應(yīng)答，并且生成大量以TNF-α為主的促破骨細(xì)胞生成因子,TNF-α誘導(dǎo)核因子κB受體活化因子配體和巨噬細(xì)胞集落刺激因子的生成，并下調(diào)骨保護(hù)素，最終促進(jìn)破骨細(xì)胞的激活和骨吸收[17]。 Xiao等[18]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌組與無(wú)特定病原體 (SPF) 組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)，并檢測(cè)它們誘導(dǎo) T 細(xì)胞凋亡的能力，發(fā)現(xiàn) SPF 組顯著誘導(dǎo)更多的 T 細(xì)胞凋亡。綜上所述，腸道菌群失調(diào)、腸道上皮屏障功能減弱和免疫系統(tǒng)反應(yīng)性增強(qiáng)，導(dǎo)致腸道致病菌有害代謝物可以通過(guò)腸道上皮屏障進(jìn)入機(jī)體，進(jìn)一步引發(fā)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，生成大量以TNF-α為主的促破骨細(xì)胞生成因子，最終促進(jìn)破骨細(xì)胞的激活和骨吸收。

1.4 中藥和腸道菌群相互作用中藥具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，保護(hù)腸黏膜屏障的作用，而腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化中藥有效成分，使其更易被機(jī)體吸收，還有增強(qiáng)藥效、降低毒性的作用。傳統(tǒng)中藥吸收利用度不高，但療效好，因腸道菌群在其中的轉(zhuǎn)化作用。腸道菌群對(duì)中藥成分的生物轉(zhuǎn)化以水解作用為主，氧化還原作用為輔，在這些水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等代謝酶的作用下，中藥成分轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的藥理或毒理成分而發(fā)揮作用[19]。迄今已發(fā)現(xiàn)的植物雌激素有400多種, 其中腸道菌群對(duì)黃酮類(lèi)、異黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)研究較多。

異黃酮類(lèi)在腸道菌群的轉(zhuǎn)化下會(huì)代謝成雌馬酚，而雌馬酚具有更強(qiáng)雌激素樣作用，對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)防有較好的療效。木脂素類(lèi)化合物如松脂醇二葡萄糖苷以及牛蒡苷等需經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化為哺乳動(dòng)物中的木脂素如腸二醇和腸內(nèi)脂后，才能呈現(xiàn)出一定的雌激素樣活性，動(dòng)物木脂素在結(jié)構(gòu)上與雌二醇等內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)相似。因此，可與內(nèi)源性雌激素競(jìng)爭(zhēng)性與雌激素受體(ER)結(jié)合，抑制或結(jié)合ER，進(jìn)而產(chǎn)生雙相的雌激素或抗雌激素樣作用，用于治療骨質(zhì)疏松[20-21]。

2 靶向腸道制劑

2.1 益生元治療骨質(zhì)疏松根據(jù)定義，益生元纖維具有抗吸收性，并且通過(guò)下腸中的結(jié)腸微生物群水解和發(fā)酵。當(dāng)以足夠的量摻入飲食中時(shí)，期望的結(jié)果是它們將選擇性地刺激對(duì)宿主具有有益作用的一些細(xì)菌的生長(zhǎng)[22]。近年來(lái)，以腸道菌群為靶點(diǎn)治療骨質(zhì)疏松成為熱點(diǎn)，多種實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)充益生元對(duì)骨質(zhì)疏松癥有治療作用。益生元在各種食物中發(fā)現(xiàn)的化合物中含有，例如菊苣，大蒜，韭菜，香蕉，洋蔥和麩皮中。二糖具有兩個(gè)糖單元，例如乳果糖或乳糖醇，它是最早與腸道微生物群體相關(guān)的益生元之一。低聚糖含有3～10個(gè)糖單位。包括短鏈低聚果糖、低聚半乳糖。較長(zhǎng)鏈接的益生元>10單位包括菊粉和抗性淀粉。低聚果糖均增加雌激素缺乏的卵巢切除大鼠的鈣吸收，還可通過(guò)減少雄性衰老小鼠的全身炎癥，改善腸道微生物群，減少骨吸收[23]。口服甘露聚糖對(duì)大鼠牙周炎引起的牙槽骨丟失具有保護(hù)作用，在保護(hù)腸道的同時(shí)，可改變組織學(xué)和免疫炎性參數(shù)[24]。Tousen等[25]發(fā)現(xiàn)，抗性淀粉通過(guò)改變腸道菌群的組成，從而下調(diào)去卵巢小鼠骨髓中核因子 kappa-B 配體受體激活因子和IL-7受體基因的表達(dá)，從而減輕卵巢切除引起的骨質(zhì)流失。

2.2 中藥治療骨質(zhì)疏松依據(jù)補(bǔ)充益生元能夠有效治療骨質(zhì)疏松癥，將腸道菌群作為藥物治療骨質(zhì)疏松的新靶點(diǎn)，對(duì)藥物產(chǎn)生藥效做出新闡釋。以納豆芽孢桿菌發(fā)酵大豆而得的納豆具有溶血栓、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥以及調(diào)節(jié)腸功能等許多作用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明納豆能夠顯著促進(jìn)健康小鼠及抗生素誘導(dǎo)的腹瀉模型小鼠腸道中厭氧菌群的生長(zhǎng)，抑制好氧菌群的增殖，有望成為一種益生元類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)中[26]。在慢性炎癥性腸病動(dòng)物模型中適度提高大豆飲食，可以降低腸道炎癥分?jǐn)?shù)和結(jié)腸基因表達(dá)的 TNF-α,有效地減輕腸道炎癥、淋巴結(jié)構(gòu)改變和有益地改變骨代謝。大豆素是一種在大豆中發(fā)現(xiàn)的主要異黃酮，可通過(guò)腸道菌群代謝為雌馬酚，該產(chǎn)物具有比大豆苷元更強(qiáng)的雌激素活性，對(duì)骨骼健康產(chǎn)生有利影響[27]。桑樹(shù)和蒲公英水提取物可以降低大腸內(nèi)厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比例，腸道菌群的變化改變了能量代謝和葡萄糖代謝，可以治療酒精性脂肪肝引起的骨質(zhì)流失[28]。Jia 等[29]研究小檗堿治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的牙周炎，發(fā)現(xiàn)小檗堿通過(guò)富集產(chǎn)丁酸屬菌群，提高腸道丁酸鹽濃度，治療后腸道屏障完整性得到改善，腸道通透性降低，牙槽骨 IL-17A+細(xì)胞減少，IL-17A相關(guān)免疫反應(yīng)減弱，明顯降低了去卵巢-牙周炎大鼠的牙槽骨丟失，改善了骨代謝。Zhao等[30]研究發(fā)現(xiàn)，墨旱蓮能夠改變細(xì)菌群落從而顯著改善骨微結(jié)構(gòu)，并且發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和乳球菌的數(shù)量與墨旱蓮的劑量呈正相關(guān)。

3 展望

目前在臨床上用于治療和阻止骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的藥物分為兩大類(lèi)，第一類(lèi)為抑制骨吸收藥，包括鈣劑、維生素 D 及活性維生素 D 、降鈣素等；第二類(lèi)為促進(jìn)骨性成藥，包括氟化物、合成類(lèi)固醇、甲狀旁腺激素等。讓人感到興奮的是，近年來(lái)有大量研究表明補(bǔ)充益生菌也可以防止骨質(zhì)疏松，并且益生菌用藥治療骨質(zhì)疏松也用于臨床治療，這是區(qū)別于傳統(tǒng)防治骨質(zhì)疏松的一大突破，對(duì)于靶向腸道制劑提供了一定的理論基礎(chǔ)。本文在此的基礎(chǔ)上，梳理了腸道菌群影響骨質(zhì)疏松的可能因素，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

腸道菌群的研究是目前的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，中藥對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用逐步被認(rèn)可，現(xiàn)在大部分的研究還是停留在單味藥，而在中醫(yī)基礎(chǔ)理論下，中藥經(jīng)過(guò)炮制配伍能夠更好地發(fā)揮藥效，而對(duì)于中藥復(fù)方的研究較少，是不足所在。中藥復(fù)方治療骨質(zhì)疏松的療效得到認(rèn)可，但中藥復(fù)方化學(xué)成分極其復(fù)雜，其對(duì)骨質(zhì)疏松的治療是多途徑和多靶點(diǎn)的，目前對(duì)中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)還有待在分子水平和基因水平進(jìn)行深入的研究，而腸道菌群作為新靶點(diǎn)，為中藥治療骨質(zhì)疏松提供了新的闡釋?zhuān)材軌驈哪c道新靶點(diǎn)探尋更多藥物預(yù)防與治療骨質(zhì)疏松癥。而是否所有靶向腸道制劑的中藥都能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松呢？骨質(zhì)疏松究竟和哪些特殊的菌群或者菌落有密切關(guān)系，目前研究還較少，不能夠篩選出靶向腸道制劑治療骨質(zhì)疏松的最佳中藥復(fù)方。之后，我們需要針對(duì)如何將中藥復(fù)方中的某些最有效成分群與治療骨質(zhì)疏松最有效腸道菌聯(lián)系起來(lái)，制備出療效顯著的新劑型，明確中藥復(fù)方如何通過(guò)腸道菌群治療骨質(zhì)疏松進(jìn)行深入研究。