丹參酮ⅡA在肝臟疾病中的作用及其新劑型的研究進(jìn)展

張 誼，王立暉，王惠霞，朱紅濤，吳明海，周 婷，黃曉佳

(1.南通大學(xué)附屬丹陽(yáng)醫(yī)院，江蘇 丹陽(yáng) 212300；2. 常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，江蘇 常州 213164)

隨著人口老齡化的加速，肝臟疾病的發(fā)生率和死亡率日趨上升。盡管有疫苗接種計(jì)劃和抗病毒藥物的使用，但由于長(zhǎng)期不良的生活習(xí)慣和營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，全球肝病問(wèn)題進(jìn)一步加重，已經(jīng)嚴(yán)重影響著人類(lèi)的健康。因此，開(kāi)發(fā)有效的肝病治療和預(yù)防藥物已迫在眉睫。丹參為唇形科植物鼠尾草屬丹參的干燥根和莖，丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA, Tan ⅡA)是其有效脂溶性成分之一，具有廣泛的藥理活性。但Tan ⅡA是小分子脂溶性物質(zhì)，口服吸收差，生物利用度低，臨床使用受限，因此，研究和開(kāi)發(fā)新的Tan ⅡA劑型受到越來(lái)越多的關(guān)注。本文就近十年來(lái)對(duì)Tan ⅡA在肝臟疾病中的作用機(jī)制研究及劑型的發(fā)展進(jìn)行綜述。

1 Tan ⅡA在肝臟疾病中的作用

1.1 Tan ⅡA在炎癥相關(guān)性肝損傷中的作用炎癥相關(guān)性肝損傷是一種由多種肝臟炎癥性疾病所引起的肝臟損傷，其具體的致病因素包括炎癥因子的釋放、活性氧自由基的激活、氧化應(yīng)激損傷以及線粒體功能障礙。Tan ⅡA具有顯著的抗炎及抗氧化作用，可保護(hù)肝細(xì)胞，減輕肝臟損傷，如Tan ⅡA可通過(guò)下調(diào)炎性介質(zhì)高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)蛋白和mRNA表達(dá)，抑制細(xì)胞腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等其他炎癥因子的釋放，繼而減輕大鼠肝細(xì)胞損傷[1]；也可通過(guò)作用于網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)HMGB1的攝取作用，從而降低肝損傷[2]。此外，Tan ⅡA能夠通過(guò)抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路，減少炎癥細(xì)胞的活化，如通過(guò)下調(diào)p38和NF-κB表達(dá)，抑制促炎因子白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-6和TNF-α的釋放，減輕肝臟的損傷[3]。

正常情況下，細(xì)胞氧化與抗氧化能力處于平衡狀態(tài)，過(guò)量的氧自由基可破壞生物膜而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，是肝損傷的重要原因之一。Tan ⅡA具有良好的抗氧化應(yīng)激作用，有明顯的肝臟細(xì)胞保護(hù)作用。在雷公藤內(nèi)酯醇與對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中，Tan ⅡA處理可顯著增強(qiáng)肝細(xì)胞活力并改善肝功能指標(biāo)，降低大鼠肝細(xì)胞中的丙二醛活性，提高其超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶的含量[4-5]。此外，Tan ⅡA可抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成，可能與其激活孕烷X受體而誘導(dǎo)肝臟中代謝酶CYP3A表達(dá)有關(guān)[6]。

1.2 Tan ⅡA在肝纖維化中的作用肝臟發(fā)生持續(xù)性損傷時(shí)，刺激細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的生成和降解平衡失控，過(guò)多的ECM聚集在肝臟內(nèi)，重塑肝臟的組織結(jié)構(gòu)，形成纖維瘢痕，導(dǎo)致肝纖維化。肝臟中主要產(chǎn)生ECM的細(xì)胞是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)，其在激活后轉(zhuǎn)化為表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白的肌成纖維細(xì)胞。目前認(rèn)為，HSC的激活是肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC的活化和促進(jìn)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效途徑之一。

在各種致病因素的作用下，細(xì)胞因子可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活HSC。NF-κB信號(hào)通路是經(jīng)典的通路之一，可通過(guò)促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌，誘導(dǎo)HSC活化，因此阻斷其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)則可抑制HSC的激活。Tan ⅡA預(yù)處理脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的大鼠HSC，可明顯抑制HSC中NF-κB-p65的核轉(zhuǎn)位及蛋白表達(dá)，減弱炎癥因子表達(dá)，從而保護(hù)肝細(xì)胞[7]。除了NF-κB信號(hào)通路，Tan ⅡA還能夠阻斷TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，減少HSC中的TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA的表達(dá)，抑制MAPK信號(hào)通路，從而抑制HSC的活化[7-9]。

HSC激活過(guò)程很難被逆轉(zhuǎn)，促進(jìn)其凋亡也是減少HSC活化的主要方式。在肝纖維化恢復(fù)期，活化HSC的清除主要依賴于其凋亡。Tan ⅡA可以激活ERK-Bax-caspase途徑，釋放線粒體細(xì)胞色素C，誘導(dǎo)caspase-3裂解，上調(diào)Bax/Bcl-2蛋白比例，同時(shí)抑制Akt的磷酸化，從而促進(jìn)HSC凋亡[10]；也可通過(guò)改變細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E來(lái)誘導(dǎo)活化HSC中S期細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。

1.3 Tan ⅡA在非酒精性脂肪肝中的作用非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝應(yīng)激性肝臟損傷，其臨床病理的主要特征是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化。

NAFLD最初表現(xiàn)為脂肪變性，在炎癥因子誘導(dǎo)下進(jìn)一步發(fā)展成NAFLD。Tan ⅡA衍生的水溶性化合物丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate, STS)可通過(guò)降低TNF-α、TGF-β1以及IL-1的轉(zhuǎn)錄，抑制油酸和棕櫚酸處理的人肝癌細(xì)胞HepG2和原代永生化人肝細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)積累，減輕肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積[12]。對(duì)高脂血癥大鼠，Tan ⅡA可通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟低密度脂蛋白受體、肝臟固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-2以及相關(guān)膽固醇基因的表達(dá)；還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)miR-33a和SREBP-2/Pcsk9信號(hào)通路蛋白來(lái)減輕高脂血癥大鼠肝臟中的脂質(zhì)沉積[13-14]。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)是一類(lèi)核受體，可介導(dǎo)脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，已成為治療NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)，活化的PPARγ調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸儲(chǔ)存，其過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)積累。

1.4 Tan ⅡA在肝癌中的作用肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種信號(hào)通路都有密切關(guān)系。在人肝癌HepG2細(xì)胞中，Tan ⅡA可通過(guò)miR30b-p53-PTPN11/SHP2信號(hào)途徑來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的死亡[15]；也能夠降低金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)，阻斷NF-κB的活化而抑制HCC細(xì)胞在體外和體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。

凋亡在肝癌細(xì)胞中也起著重要角色。在體外，Tan ⅡA可以通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G2/M期和G0/G1期，抑制人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖[17-18]。Tan ⅡA處理HepG2細(xì)胞后，半胱天冬酶-8形成同型二聚體，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶裂解，RIP1/RIP3復(fù)合物引起了細(xì)胞壞死性凋亡，表明Tan ⅡA可引起細(xì)胞壞死性凋亡[19]。

多項(xiàng)研究也證實(shí)，Tan ⅡA與其他藥物同時(shí)應(yīng)用還可發(fā)揮協(xié)同作用。Tan ⅡA可加強(qiáng)P-糖蛋白的表達(dá)，抑制多柔比星在HCC細(xì)胞中的流出[20]。同樣，Tan ⅡA可與反式白藜蘆醇結(jié)合而發(fā)揮協(xié)同作用，產(chǎn)生與順鉑相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，使細(xì)胞周期停滯G1期和DNA片段化，誘導(dǎo)HepG2和HCC細(xì)胞凋亡[21]。

2 Tan ⅡA在肝臟疾病中新劑型的研究

由于Tan ⅡA對(duì)肝臟疾病具有明顯的治療效果，為克服其口服吸收生物利用度低，以及水溶性差的缺點(diǎn)，研究者們嘗試Tan ⅡA的多種新劑型，以提高Tan ⅡA的生物利用度，降低不良反應(yīng)，達(dá)到更好的藥效。

2.1 納米顆粒納米技術(shù)是一種增加藥物溶解度的有用方法，攜藥納米顆粒靶向治療疾病已經(jīng)取得巨大進(jìn)步，但由于生物可降解性、免疫相容性、生物利用度和生物相容性等原因，常選用蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)作為遞送藥物的載體[22]。

將血紅蛋白中的珠蛋白溶液加入到Tan ⅡA乙醇溶液中可獲得Tan ⅡA負(fù)載珠蛋白納米顆粒(TA-Gb-NPs)，該納米顆粒增加了Tan ⅡA的水溶性，具有良好的肝臟靶向能力，使藥物在肝臟中有更高的濃度和更長(zhǎng)的保留時(shí)間，能顯著改善硫代乙酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，可成為治療肝纖維化的藥物載體[23]。以水包油乳液/溶劑蒸發(fā)方法可得到Tan ⅡA聚乳酸納米顆粒(TS-PLA-NPs)，對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性，可預(yù)防小鼠腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)肝癌小鼠存活時(shí)間[24]。而負(fù)載在甲氧基聚乙二醇，聚乳酸-乙醇酸，聚L-賴氨酸和環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸中的Tan ⅡA納米顆粒(TNPs)可用于治療體內(nèi)外肝細(xì)胞癌，穩(wěn)定性較好，并具有均勻的尺寸分布，可延長(zhǎng)Tan ⅡA釋放的時(shí)間并提高腫瘤靶向活性[25]，是一種新型靶向治療肝癌的載藥系統(tǒng)。

2.2 聚合物膠束聚合物膠束由于其高載藥量和體內(nèi)長(zhǎng)期循環(huán)而成為一種有前途的藥物遞送載體。傳統(tǒng)的聚合膠束特異性差、生物安全性低，可設(shè)計(jì)具有多功能的載藥膠束。

將甘草次酸(GA)與聚乙二醇-二硫化物鍵的聚乳酸共乙醇酸偶聯(lián)，可得到雙官能團(tuán)可生物降解的膠束體系(GA-PEG-SS-PLGA)，實(shí)現(xiàn)肝癌靶向和氧化還原反應(yīng)性細(xì)胞內(nèi)藥物釋放。Tan ⅡA封裝于多功能膠束后，表現(xiàn)出在肝臟快速聚集和更快的藥物釋放，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在S期，上調(diào)凋亡蛋白caspase-3、p38蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在小鼠腫瘤模型中具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用，說(shuō)明該聚合膠束是一種新的Tan ⅡA遞送系統(tǒng)，有望用于肝癌的治療[26]。

2.3 固體分散體固體分散體是一種將藥物高度分散在固體載體中形成的固體分散系統(tǒng)，一般粒徑為1～100 μm，固體分散體可以將液態(tài)藥物固態(tài)化，以掩蓋藥物的不良?xì)馕?，可緩慢釋放藥物，減慢藥物的水解以及氧化。

多孔二氧化硅的表面上具有許多硅烷醇基團(tuán)，可以用作藥物賦形劑，用多孔二氧化硅制備的固體分散體可以改善藥物的溶出速率和穩(wěn)定性。體外溶出研究中，Tan ⅡA與多孔二氧化硅以1 ∶8的比例混合制備的固體分散體，能夠表現(xiàn)出顯著改善體外溶出速率，在室溫條件下儲(chǔ)存12個(gè)月，藥物溶出略有下降，但能保持物理穩(wěn)定性。生物利用度實(shí)驗(yàn)中，固體分散體的Tan ⅡA表現(xiàn)出更快的吸收速率和更高的生物利用度[27]。

2.4 脂質(zhì)體脂質(zhì)體屬于靶向遞藥系統(tǒng)的一種新劑型，以磷脂為膜材分散在水中，形成脂質(zhì)雙分子層，具有良好的生物相容性。通過(guò)表面修飾，脂質(zhì)體可聚集于特定組織部位，如脂質(zhì)體因被動(dòng)靶向作用而分布于內(nèi)皮系統(tǒng)豐富的組織[28]。

以新型甘草次酸衍生物——甘氨酸丁二酸甘草次酸十八烷酯為配體，采用薄膜分散-高壓乳勻法制備Tan ⅡA脂質(zhì)體，經(jīng)尾靜脈給藥后，測(cè)定小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血漿樣本，以及小鼠的心、肝、脾、肺、腎組織樣本中Tan ⅡA的含量。結(jié)果顯示Tan ⅡA脂質(zhì)體的粒徑、電位、包封率、配體結(jié)合率均符合要求，且能夠增加其在肝組織的峰濃度，表明該Tan ⅡA脂質(zhì)體具有良好的肝靶向性作用。

3 總結(jié)與展望

本文簡(jiǎn)要地綜述了Tan ⅡA在肝臟疾病方面的保護(hù)作用及其新劑型的研究現(xiàn)狀，隨著Tan ⅡA體內(nèi)、體外及臨床試驗(yàn)的深入研究，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制對(duì)擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍和提高其有效性具有重要意義。

目前，Tan ⅡA在肝病中的作用研究主要集中在其治療肝臟損傷和肝癌作用上，對(duì)于抗肝纖維化的研究相對(duì)較少，而肝纖維化是各種慢性肝病的必要途徑，進(jìn)一步研究Tan ⅡA在肝纖維化中的作用具有重要的意義。此外，大多數(shù)研究對(duì)象僅限于離體培養(yǎng)的肝細(xì)胞，以及嚙齒動(dòng)物模型，對(duì)其作用機(jī)制的研究相對(duì)較少且比較淺顯。為確保Tan ⅡA臨床使用的安全性和有效性，需要進(jìn)行大規(guī)模的隨機(jī)臨床試驗(yàn)和進(jìn)一步的科學(xué)研究，以揭示Tan ⅡA的作用機(jī)制，也有利于推廣Tan ⅡA作為治療肝病的替代藥物。

提高Tan ⅡA的水溶性并增加其在血漿中的濃度具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，良好的載藥體系可增加Tan ⅡA在肝組織中的濃度，部分解決其口服吸收差，生物利用度低以及體內(nèi)消除快的缺點(diǎn)，但是仍有一些問(wèn)題有待解決。新載體材料的開(kāi)發(fā)仍具有重要意義，如開(kāi)發(fā)粒徑小，無(wú)毒，生物降解性和生物相容性好，在血液循環(huán)中穩(wěn)定，能夠穿過(guò)血腦脊液屏障，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬，并能在血液循環(huán)中保留較長(zhǎng)時(shí)間的材料，以進(jìn)一步提高Tan ⅡA治療肝臟疾病的作用。

總之，隨著研究人員對(duì)Tan ⅡA在肝病學(xué)中作用機(jī)制的研究，優(yōu)良制備技術(shù)的開(kāi)發(fā)，有效衍生物的研制，Tan ⅡA在肝臟疾病中的應(yīng)用將得到更廣泛的認(rèn)可，使其在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。