狂犬病病毒糖蛋白重組表達(dá)及其基因工程疫苗研究進(jìn)展

張瑩輝，姚文生，康 凱，薛 麒，李啟紅，陳小云，杜吉革，朱 真，印春生

1 狂犬病病毒(RV)及其G蛋白(RVGP)

狂犬病病毒(Rabies virus，RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae) 狂犬病毒屬 (Lyssavirus)，是一種具有包膜的單鏈負(fù)股RNA病毒，它攜帶有5種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、包膜糖蛋白和依賴(lài)RNA的RNA聚合酶[1]。RVGP是一種跨膜蛋白，天然的RVGP具有三聚體結(jié)構(gòu)，構(gòu)成了病毒表面的棘突[2]，在病毒出芽之前，RVGP位于狂犬病病毒包膜和感染細(xì)胞的質(zhì)膜中，包含胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，疏水性跨膜區(qū)域和胞外區(qū)域，3種單體的結(jié)合形成了三聚體[3]。它是目前發(fā)現(xiàn)的唯一可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原，也是唯一一種存在于所有新型狂犬病疫苗中的成分[4]。RVGP的免疫原性很可能依賴(lài)于其三聚體空間構(gòu)象[5]，它能夠在一定程度上誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而保護(hù)其不受狂犬病病毒的攻擊[6]。研究顯示RVGP存在3種不同的構(gòu)象，即天然構(gòu)象、低pH無(wú)活性構(gòu)象和疏水的瞬時(shí)構(gòu)象，在低pH環(huán)境中，三種構(gòu)象的轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)了病毒和細(xì)胞膜融合，從而完成感染的過(guò)程[7]，此外，有研究者發(fā)現(xiàn)糖基化對(duì)RVGP的抗原性、穩(wěn)定性及其正確表達(dá)和分泌也具有不可忽視的重要作用[8]，經(jīng)過(guò)正確糖基化的RVGP分子可誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答。

2 rRVGP在不同細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)研究進(jìn)展

傳統(tǒng)的狂犬病疫苗是由活的或滅活的狂犬病病毒組成的，從以巴斯德狂犬病疫苗為起始的神經(jīng)組織疫苗到禽胚疫苗，再到細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，狂犬病疫苗不斷的改進(jìn)和完善[9]，目前Vero細(xì)胞系狂犬病疫苗已大量生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用于人和動(dòng)物狂犬病的預(yù)防和暴露后接種。傳統(tǒng)疫苗中含有與野毒株相同特征的抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)RVGP的病毒中和抗體，同時(shí)活化輔助細(xì)胞以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而對(duì)致死性的狂犬病毒腦內(nèi)攻擊具有保護(hù)效力[10]。目前所使用的傳統(tǒng)病毒疫苗生產(chǎn)成本較高，且存在一定的生產(chǎn)和使用風(fēng)險(xiǎn)[11]，并且在一些狂犬病發(fā)病率較高的國(guó)家，仍需要使用較為經(jīng)濟(jì)的疫苗產(chǎn)品進(jìn)行單次免疫以達(dá)到預(yù)防狂犬病的目的[12]。因而研制更加經(jīng)濟(jì)、安全、有效的新型狂犬病疫苗成為越來(lái)越多研究者關(guān)注的重點(diǎn)，目前正在研發(fā)中的新型狂犬病疫苗主要有亞單位疫苗、DNA疫苗、活載體疫苗等[13]。

建立rRVGP表達(dá)系統(tǒng)，不僅要能夠產(chǎn)生高濃度的rRVGP，同時(shí)還要分析其與天然結(jié)構(gòu)RVGP間的相似度，比較接種動(dòng)物后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是其最好的分析方法。在天然合成過(guò)程中，RVGP經(jīng)過(guò)翻譯和修飾，至少有一個(gè)序列進(jìn)行了糖基化，因而其能夠到達(dá)細(xì)胞表面[14]，但在表達(dá)rRVGP過(guò)程中，常常為了獲得高水平的rRVGP而使用了不穩(wěn)定的和疏水性的分子，因而存在一定的不可溶問(wèn)題。雖然使用遺傳和生物化學(xué)方法可以獲得具有免疫原性且可溶的rRVGP，但重組分子本身免疫原性的大小取決于其寡聚體的結(jié)構(gòu)[15]，因此這些方法所產(chǎn)生的蛋白分子免疫原性并不高[16]，不過(guò)其作為診斷工具仍具有潛在的價(jià)值[17]。這也體現(xiàn)出了跨膜結(jié)構(gòu)的重要作用，因?yàn)樵谡_折疊的胞外區(qū)域中包含著最重要的抗原表位[18]。有研究者將重組RVGP全長(zhǎng)基因和截短(去除跨膜結(jié)構(gòu))基因的載體所表達(dá)的兩種rRVGP注入小鼠，結(jié)果顯示前者對(duì)狂犬病毒攻擊保護(hù)率為100%，后者保護(hù)率僅為66.6%，表明了RVGP的天然跨膜結(jié)構(gòu)對(duì)小鼠的保護(hù)性免疫應(yīng)答非常重要[3]。因此，建立可以產(chǎn)生高水平的、功能性強(qiáng)的類(lèi)天然rRVGP表達(dá)系統(tǒng)十分重要。眾所周知，彈狀病毒屬成員能夠感染植物、哺乳動(dòng)物以及昆蟲(chóng)，因此可以使用不同的系統(tǒng)來(lái)表達(dá)rRVGP，在國(guó)內(nèi)外研究中，rRVGP已經(jīng)在許多細(xì)胞系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。

2.1原核系統(tǒng) 自原核系統(tǒng)表達(dá)蛋白的方法使用以來(lái)，已有許多中外學(xué)者使用不同標(biāo)簽和表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)不同長(zhǎng)度的rRVGP。將rRVGP全長(zhǎng)基因連接在含GST標(biāo)簽的pGEX-5X-1載體上，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，可以獲得溶解度較高的rRVGP，并且其具有抗原特異性，與抗狂犬病病毒抗體具有良好的親和力[19]。但大多數(shù)原核表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的rRVGP都以包涵體形式存在，這對(duì)該蛋白的純化和使用造成了一定的困難，多數(shù)只能用于實(shí)驗(yàn)室研究。

2.2真核系統(tǒng) 在真核系統(tǒng)中表達(dá)的rRVGP其N(xiāo)端進(jìn)行了糖基化，因而具有一定的免疫原性。用于表達(dá)rRVGP的真核系統(tǒng)主要有酵母系統(tǒng)、植物系統(tǒng)和昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)。

2.2.1酵母系統(tǒng) rRVGP在釀酒酵母表達(dá)載體中表達(dá)時(shí)被糖基化并與酵母中的膜結(jié)合，使用免疫印跡和免疫沉淀方法能夠檢測(cè)到這些分子，當(dāng)將其肌肉注射豚鼠時(shí)，能夠保護(hù)豚鼠免受致死性狂犬病毒攻擊，但對(duì)小鼠腦內(nèi)攻毒沒(méi)有作用[20]。另外，使用多形漢遜酵母來(lái)表達(dá)截短的rRVGP片段，能產(chǎn)生經(jīng)過(guò)正確N-糖基化的可溶性蛋白，將該蛋白純化后接種家兔，發(fā)現(xiàn)其與全長(zhǎng)的rRVGP具有相似的免疫原性，可用于檢測(cè)針對(duì)整個(gè)病毒粒子和天然糖蛋白的抗體[17]。

2.2.2植物系統(tǒng) 植物系統(tǒng)中表達(dá)rRVGP的優(yōu)點(diǎn)在于其成本低，可以大規(guī)模生產(chǎn)，且在表達(dá)過(guò)程中能夠形成正確折疊和糖基化的rRVGP[21]，且這種rRVGP可以口服給藥。例如，將狂犬病毒基因?qū)胗衩谆蚪M中，rRVGP可以在玉米籽粒中以高水平表達(dá)并長(zhǎng)期儲(chǔ)存而不會(huì)過(guò)度變質(zhì)，將其對(duì)綿羊給藥時(shí)，可產(chǎn)生與商業(yè)疫苗相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)效果[22]。但當(dāng)將其用于暴露后接種時(shí)，口服免疫也許不能完全抵抗病毒的攻擊，因此限定了該方法只適用于感染之前的預(yù)防接種。

2.2.3昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng) 研究表明，在昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)種表達(dá)的rRVGP具有良好的免疫原性，能夠保護(hù)某些動(dòng)物免受致命狂犬病毒攻擊，具有一定的使用價(jià)值。例如使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)克隆rRVGP基因，并在草地夜蛾細(xì)胞(Sf9)中表達(dá)，可獲得高效表達(dá)的rRVGP，免疫小鼠后其血清具有中和活性，表明這種表達(dá)方法保留了rRVGP天然構(gòu)象的生物活性[23]。陳奇等[24]人構(gòu)建了表達(dá)狂犬病病毒SRV9株糖蛋白的重組桿狀病毒載體，轉(zhuǎn)染至Sf9中表達(dá)，將其表達(dá)產(chǎn)物接種小鼠可誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗狂犬病病毒中和抗體，100%達(dá)到了中和抗體的保護(hù)水平。使用質(zhì)粒載體在果蠅S2細(xì)胞中也能表達(dá)rRVGP，由于S2細(xì)胞的生長(zhǎng)不依賴(lài)固體底物，因此這些細(xì)胞可大量懸浮培養(yǎng)[25]。同時(shí)，在S2細(xì)胞中產(chǎn)生的rRVGP是寡聚化的，且具有免疫原性，能保護(hù)小鼠免受狂犬病病毒的攻擊[26]。

2.3哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的蛋白其分子結(jié)構(gòu)和理化特性最接近天然的高等生物蛋白，目前，許多第二代狂犬病疫苗都是基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的，但只有少數(shù)方法表達(dá)出了穩(wěn)定的rRVGP，其中一個(gè)原因可能是在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中所表達(dá)的rRVGP其糖基化模式與所使用的細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)，而且可能隨著細(xì)胞培養(yǎng)條件的改變而變化[27]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在BHK-21細(xì)胞中產(chǎn)生的rRVGP依賴(lài)于相應(yīng)的培養(yǎng)條件才能形成必要的抗原表位[28]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)蛋白生產(chǎn)周期較長(zhǎng)且蛋白產(chǎn)量低，因此大大提高了生產(chǎn)成本，也是該系統(tǒng)的缺陷所在。

2.4病毒載體系統(tǒng) 許多病毒經(jīng)過(guò)基因工程改造后可用于表達(dá)rRVGP，目前已有越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始關(guān)注這一狂犬病疫苗開(kāi)發(fā)的新方法。目前狂犬病的重組活載體疫苗研究主要包括基因重組痘病毒減毒活疫苗、痘病毒載體疫苗、腺病毒載體疫苗以及新城疫病毒載體疫苗、偽狂犬病毒載體疫苗、副流感病毒載體疫苗、犬瘟熱病毒載體疫苗等，這些疫苗在免疫動(dòng)物后都具備安全性，且經(jīng)過(guò)口服或肌肉注射給藥后能產(chǎn)生一定的保護(hù)效力，而且這些病毒載體均為常見(jiàn)的弱毒毒株，作為疫苗生產(chǎn)用弱毒株廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，均有良好的安全性，因此重組后能夠表達(dá)rRVGP的病毒亦有較好的生物安全性。利用減毒牛痘病毒(VACV)重組其他遺傳物質(zhì)能夠產(chǎn)生針對(duì)多種感染因子的新型疫苗，包括編碼狂犬病病毒糖蛋白的重組VACV，將其對(duì)野生動(dòng)物口服給藥，能夠很好的預(yù)防野生動(dòng)物狂犬病[29]。有報(bào)告顯示將減毒重組VACV載體疫苗以口服的方式在全球范圍內(nèi)使用，2.5億劑疫苗中沒(méi)有任何野生動(dòng)物的不良反應(yīng)報(bào)告，該疫苗在50種脊椎動(dòng)物中都具有安全性，且對(duì)多種動(dòng)物具有免疫原性和功效[30]。牛痘-狂犬病糖蛋白重組口服疫苗和腺病毒-狂犬病糖蛋白重組口服疫苗對(duì)浣熊的狂犬病防治也有一定的效果[31]。腺病毒-狂犬病重組疫苗能夠使用人腺病毒載體來(lái)表達(dá)具有免疫原性rRVGP，將其對(duì)紅狐貍給藥后，發(fā)現(xiàn)血清樣品中連續(xù)16周存在狂犬病毒中和抗體，在對(duì)病毒攻擊保護(hù)方面，最長(zhǎng)可達(dá)一年以上時(shí)間[32]。王穎等[33]人將狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆到腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒，并獲得表達(dá)狂犬病病毒SRV9株rRVGP的缺陷型重組人5型腺病毒，將該腺病毒腹腔接種昆明小鼠，14d后均產(chǎn)生了抗狂犬病中和抗體，有效保護(hù)率達(dá)90%。另外，將表達(dá)rRVGP的重組無(wú)毒新城疫病毒 La Sota毒株(rL-RVG)對(duì)動(dòng)物肌內(nèi)接種，可誘導(dǎo)大量狂犬病病毒中和抗體產(chǎn)生，能夠?qū)B續(xù)狂犬病病毒攻擊提供完全保護(hù)[34]。同時(shí)新城疫活載體疫苗可以通過(guò)多種途徑免疫，即便通過(guò)呼吸道免疫也能夠引起有效的免疫反應(yīng)，且新城疫病毒不會(huì)整合到宿主基因組中，具有良好的生物安全性[35]，于桂梅等[35]人構(gòu)建的重組NDV能夠使rRVGP穩(wěn)定高效表達(dá)，在犬、貓和老鼠注射后能夠產(chǎn)生大量針對(duì)RV的中和抗體。此外，為研制新型有效的狂犬病重組活載體疫苗, 袁子國(guó)[36]、李業(yè)偉[37]分別構(gòu)建了能夠表達(dá)狂犬病病毒CVS-11株和SRV9株糖蛋白的重組偽狂犬病病毒，分別對(duì)犬和貓進(jìn)行肌肉注射免疫，結(jié)果顯示重組病毒可以有效地刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具有一定的免疫保護(hù)效力，能夠達(dá)到滅活疫苗的相應(yīng)水平，另外口服給藥的免疫保護(hù)力低于肌肉注射?？袢《咎堑鞍字亟M副流感病毒5(PIV5-G)作為狂犬病病毒感染的新型療法，也能夠保護(hù)小鼠免受狂犬病病毒感染[38]，因此PIV5-G重組疫苗對(duì)于預(yù)防和治療狂犬病毒感染具有一定的應(yīng)用前景。反向遺傳技術(shù)使得犬瘟熱病毒作為疫苗載體也具有一定的應(yīng)用潛力，李翠霞等[39]人構(gòu)建的犬瘟熱病毒/狂犬病病毒二聯(lián)活載體疫苗可在犬體內(nèi)產(chǎn)生遠(yuǎn)高于RV中和抗體保護(hù)臨界值的特異性抗體，為研制高效、安全、廉價(jià)的CDV-RV二聯(lián)活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

3 rRVGP作為疫苗使用的問(wèn)題及意義

在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的rRVGP需要進(jìn)行純化后才能用作疫苗接種。對(duì)rRVGP進(jìn)行純化最大的挑戰(zhàn)是將rRVGP與其他蛋白分離，同時(shí)要保留它的三聚體結(jié)構(gòu)以及重要的抗原表位，細(xì)胞冷凍、解凍、裂解和濃縮都對(duì)rRVGP的純化有著重要的影響。許多純化方法都會(huì)使糖蛋白的寡聚體狀態(tài)遭到破壞，喪失重要的抗原表位，從而使其缺乏應(yīng)有的免疫原性。在有洗滌劑存在的條件下，可以避免rRVGP的聚集和沉淀。如使用CHAPS去污劑與Tris、NaCl、10%二甲基亞砜(DMSO)和EDTA配制洗滌劑，能夠使rRVGP大量溶解，在進(jìn)行小鼠試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)其能夠保護(hù)小鼠100%免受致命狂犬病毒的攻擊[40]。同時(shí)，重組動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中膜蛋白的表達(dá)水平通常較低，因此，在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的rRVGP大多只能用作免疫學(xué)分析，只有少部分能作為商品化疫苗進(jìn)行生產(chǎn)。

病毒活載體疫苗由于能夠直接在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生具有天然結(jié)構(gòu)和免疫原性的rRVGP，且能夠刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生能夠抵抗狂犬病毒攻擊的特異性抗體，因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者將其作為下一代狂犬病疫苗進(jìn)行了廣泛的研究，不同種類(lèi)的病毒載體疫苗在研發(fā)過(guò)程中的臨床應(yīng)用中都表現(xiàn)出了很好的安全性和免疫效力。目前口服的狂犬病重組痘病毒減毒活疫苗的應(yīng)用已在消除某些歐洲國(guó)家和美國(guó)野生動(dòng)物狂犬病中起到了良好的作用，同時(shí)也已用于控制以色列野生動(dòng)物狂犬病長(zhǎng)達(dá)十多年。由于在體外環(huán)境中產(chǎn)生rRVGP的質(zhì)量和數(shù)量與體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的有所不同，因此在研發(fā)病毒載體型rRVGP疫苗時(shí)，其在病毒體內(nèi)產(chǎn)生及遞送的rRVGP量對(duì)于提高保護(hù)性免疫應(yīng)答具有重要的作用，是疫苗質(zhì)量的決定性的指標(biāo)。不同病毒載體在刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)方面存在一定的差異，如痘病毒和腺病毒載體容易受母源抗體和體內(nèi)中和抗體的影響，而皰疹病毒所受影響則較小，容易產(chǎn)生持續(xù)的免疫反應(yīng)。病毒載體疫苗作為一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，其在基因重組后的安全性和遺傳穩(wěn)定性也是評(píng)估疫苗能否持續(xù)發(fā)揮作用的重要標(biāo)準(zhǔn)。

4 展 望

雖然大量研究者致力于研究基于細(xì)胞膜表達(dá)的rRVGP作為狂犬病疫苗使用的可能性，但鑒于細(xì)胞膜上rRVGP的表達(dá)水平有限、純化困難以及免疫原性無(wú)法保證等原因，使用各種細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)rRVGP都僅限于實(shí)驗(yàn)研究或免疫學(xué)分析，很少有真正用于商品化生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品。而近年來(lái)研究熱度比較高的病毒載體疫苗，可使rRVGP在產(chǎn)生時(shí)具有同天然RVGP相似性很高的抗原表位和免疫原性，且能直接釋放到靶動(dòng)物體內(nèi)，無(wú)需人工進(jìn)行純化，這種病毒載體疫苗用于狂犬病免疫更簡(jiǎn)單和直接，是相較于其他基因工程疫苗和傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗更廉價(jià)和高效的疫苗。目前，國(guó)內(nèi)已有研發(fā)重組腺病毒載體的rRGVP疫苗并已獲得臨床試驗(yàn)審批，有望在今后幾年用于生產(chǎn)實(shí)踐。在世界范圍內(nèi)病毒載體疫苗也將是狂犬病疫苗下一步的研發(fā)重點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景，其安全性和靶向性是未來(lái)重要的研究方向。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：張瑩輝，姚文生，康 凱，等. 狂犬病病毒糖蛋白重組表達(dá)及其基因工程疫苗研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(1):65-69. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.178