CircRNA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展①

招春飛 李文生 廖淑珍 王思捷 劉華鋒 潘慶軍

(湛江市慢性腎臟病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，湛江 524001)

自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)對自身的組織結(jié)構(gòu)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而造成自身組織損害所引起的一類疾病，典型疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)等。SLE是一種女性高發(fā)，特別是育齡期女性，可累及多系統(tǒng)的(腎臟、皮膚、血液、神經(jīng)系統(tǒng)等)，高度個(gè)體化的自身免疫性疾病[1,2]。RA是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病。其特征是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對稱性、侵襲性關(guān)節(jié)炎癥，經(jīng)常伴有關(guān)節(jié)外器官受累及血清類風(fēng)濕因子陽性，可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失[3,4]。

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，各種生命體內(nèi)廣泛存在，具有調(diào)控生命活動(dòng)的作用。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類特殊的非編碼RNA，在真核細(xì)胞中廣泛存在，為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA，與線性RNA不同，其由前體RNA(pre-mRNA)的3′末端和5′末端共價(jià)結(jié)合形成的內(nèi)源性ncRNA，具有物種間序列保守和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以及細(xì)胞或組織特異性表達(dá)等特征[5]，在過去被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接所產(chǎn)生的。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，circRNA主要有3 種來源形式：第一種僅由外顯子組成的外顯子環(huán)狀RNA(exonic circular RNAs,ecircRNAs)是通過5′端-3′端連接成環(huán)，片段大小各異，可充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)結(jié)合天然微小RNA(miRNA)并阻斷其對靶基因表達(dá)的抑制作用，如作為miRNA的分子“海綿”發(fā)揮功能[6-9]；第二種源自內(nèi)含子套索的circRNA是通過5′-2′末端連接成環(huán)，片段大小各異，存在較穩(wěn)定[10]；第三種同時(shí)包含外顯子和內(nèi)含子的circRNA(eIciRNAs)，其片段大小為250～400 nt[11]。近年來，circRNA在SLE和RA中的研究備受關(guān)注[12]，研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可通過多種途徑發(fā)揮作用：可充當(dāng)為miRNA的分子海綿(miRNA sponge)調(diào)控其表達(dá)[13-15]；參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[16-18]；與蛋白結(jié)合互作調(diào)節(jié)[19,20]；參與蛋白翻譯等生物學(xué)功能[21-23]。由此，circRNA具備強(qiáng)大的生物學(xué)功能，其在SLE和RA發(fā)病中的作用和機(jī)制，概述如下。

1 circRNA與系統(tǒng)性紅斑狼瘡

SLE的發(fā)病主要由遺傳背景和環(huán)境互作介導(dǎo)，近年發(fā)現(xiàn)，SLE在血漿、PBMC或腎組織等組織中的circRNA表達(dá)異常[24]，并可通過多種模式，如作為miRNA sponge調(diào)控其表達(dá)等參與SLE發(fā)病[25,26]。

有研究報(bào)道，SLE患者PBMC中circIBTK源自IBTK基因位點(diǎn)的hsa_circ_0077179，表達(dá)顯著下調(diào)，并與SLEDAI評分、抗dsDNA抗體呈負(fù)相關(guān)[27]，與補(bǔ)體C3水平呈正相關(guān)；SLE患者中miR-29b的表達(dá)顯著上調(diào)，并與SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平呈正相關(guān)，與補(bǔ)體C3水平則呈負(fù)相關(guān)。另外，miR-29b可誘導(dǎo)DNA去甲基化[28-30]，可能與SLE患者常見的DNA去甲基化相關(guān)[31,32]。且miR-29b誘導(dǎo)DNA去甲基化后，可激活A(yù)KT信號通路，而circIBTK可能通過與SLE患者中的miR-29b結(jié)合，抑制miR-29b誘導(dǎo)的DNA去甲基化，從而阻止AKT信號通路的激活[27]。有研究證明SLE患者淋巴細(xì)胞中Akt-473和GSK3β(ser9)的磷酸化水平升高，Akt-GSK3β信號通路的異常激活增加了狼瘡淋巴細(xì)胞的增殖[33]。另有研究證實(shí)了SLE患者所有B淋巴細(xì)胞亞群中Akt-1(PKB)的磷酸化增加，這是PI3激酶的關(guān)鍵下游靶標(biāo)，PI3激酶調(diào)節(jié)增殖、存活和分化，PI3激酶活性受損會導(dǎo)致免疫缺陷，而其活性增強(qiáng)會導(dǎo)致自身免疫性疾病[34]。PTEN在SLE患者中低表達(dá)，PTEN表達(dá)水平與疾病活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)[32]。此研究發(fā)現(xiàn)PTEN可能是miR-29b的潛在靶標(biāo)，并驗(yàn)證了circIBTK的上調(diào)促進(jìn)了PTEN的表達(dá)并抑制了AKT的磷酸化，miR-29b的過表達(dá)顯著減弱了circIBTK誘導(dǎo)的PTEN表達(dá)的增加和AKT信號通路的失活，因此，circIBTK的下調(diào)導(dǎo)致PTEN表達(dá)降低，從而增加AKT的磷酸化；敲低miR-29b后可以顯著逆轉(zhuǎn)circIBTK抑制誘導(dǎo)的PTEN下調(diào)和AKT信號通路的激活[27]。綜上提示，circIBTK和miR-29既可作為SLE的生物標(biāo)志物，也可作為潛在的治療靶點(diǎn)。

Luan等[35]研究了初發(fā)狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)患者的腎組織中的circRNA譜和circRNA與miR-150之間的相互作用。在人腎組織中共鑒定出18 505個(gè)circRNA，與正常的腎組織相比，LN患者中有11 411個(gè)上調(diào)和7 094個(gè)下調(diào)的circRNA，其中171個(gè)在兩組之間差異顯著。選擇142個(gè)顯著上調(diào)的circRNA進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)其參與多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞(DC)的分化、細(xì)胞質(zhì)mRNA加工體的組裝、MHC蛋白復(fù)合物和肽抗原的結(jié)合等。研究顯示，過表達(dá)的circRNA可能通過調(diào)節(jié)上述生物學(xué)功能在LN的發(fā)病中起作用。KEGG分析揭示了缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路和神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路都參與調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)，而NF-κB可通過增加炎癥反應(yīng)而促進(jìn)LN的進(jìn)展[36]。此研究發(fā)現(xiàn)7個(gè)驗(yàn)證的circRNA包括circHLA-C、circZNF609、circEKL4、circFAM188A、circUBR5、circPDE4B和circSP100在LN組織中顯著上調(diào)。其中，circHLA-C與24 h尿蛋白排泄率、總腎小球中新月體腎小球占的百分比和腎臟活動(dòng)指數(shù)呈顯著正相關(guān)，有與血清肌酐呈正相關(guān)的趨勢，與LN疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，研究提示，circHLA-C可能參與LN的發(fā)病。該課題組還發(fā)現(xiàn)circHLA-C和miR-150存在負(fù)相關(guān)，并存在相互結(jié)合的位點(diǎn)。在新發(fā)的Ⅳ期LN患者中，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的circHLA-C可能通過結(jié)合miR-150，促進(jìn)腎臟損傷，包括腎小球中新月體的形成和蛋白尿的排泄等。綜上提示，circHLA-C可能通過分子海綿miR-150在LN的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[35]。

Li等[37]報(bào)道，大量circRNA在SLE患者與正常人血漿存在差異表達(dá)，包括113個(gè)上調(diào)和94個(gè)下調(diào)等，其中，has_circ_102584、has_circ_400011和has_ circ_101471在SLE患者中顯著上調(diào)，has_circ_100226在SLE患者中顯著下調(diào)。Zhang等[38]也報(bào)道了血漿和PBMC中有112個(gè)circRNA存在差異表達(dá)，包括53個(gè)上調(diào)和59個(gè)下調(diào)，其中hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308在SLE患者血漿和PBMC中下調(diào)，hsa_circRNA_001308的表達(dá)與血漿中的CRP和抗SSA及PBMC中的白細(xì)胞減少相關(guān)，hsa_circRNA_406567與血漿中的抗RNP相關(guān)。Li等[39]在SLE患者和健康對照組T細(xì)胞的circRNA表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)127個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中hsa_circ_0045272在SLE患者T細(xì)胞中顯著降低，hsa_circ_0045272可能通過下調(diào)其特定的ceRNA NM_003466(PAX8)的表達(dá)而負(fù)調(diào)控T細(xì)胞凋亡和IL-2的產(chǎn)生，提示hsa_circ_0045272在T細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用[39]。

Miao等[40]通過RNA高通量測序(RNA-seq)分析SLE患者和健康人PBMC circRNA的表達(dá)，選擇了兩個(gè)上調(diào)的circRNA(circLRRK2和circPPHLN1)和兩個(gè)下調(diào)的circRNA(circPTPN22和circMY-BL1)，確定了一個(gè)從未發(fā)表的circRNA，此circRNA命名為circPTPN22，是蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型(PTPN22)的親本基因，PTPN22已被反復(fù)證明與SLE有關(guān)[41,42]。此研究結(jié)果顯示SLEDAI評分高患者比SLEDAI評分較低患者的circPTPN22表達(dá)水平要低，所有SLE患者治療前circPTPN22的表達(dá)水平比健康對照組的低，反映了circPTPN22表達(dá)水平與SLE患者的SLEDAI得分呈負(fù)相關(guān)[40]；此外SLEDAI評分較高的患者經(jīng)過長期激素治療可顯著提高circPTPN22水平，因此推斷circPTPN22不僅與SLE疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，而且還可能反映了SLE患者的治療效果。但是其臨床意義和潛在機(jī)制仍未明確，例如，總淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或CD4+或CD8+T細(xì)胞是否表達(dá)相同水平的circPTPN22,治療是否會引起這些細(xì)胞亞群數(shù)量的任何變化。

Zhang等[43]在SLE患者和健康對照組CD4+T細(xì)胞經(jīng)過circRNA基因芯片分析得到circRNA表達(dá)譜。SLE患者組中有12個(gè)circRNA上調(diào)，而2個(gè)circRNA下調(diào)。SLE患者h(yuǎn)sa_circ_0012919水平比健康對照組顯著上調(diào)，SLE患者合并關(guān)節(jié)損害、LN、抗dsDNA(+)、抗Sm(+)、C3或C4缺乏癥的hsa_circ_0012919表達(dá)明顯高于無這些癥狀的患者，hsa_circ_0012919表達(dá)與C3和C4水平呈負(fù)相關(guān)，并且未接受藥物治療的患者的hsa_circ_0012919表達(dá)明顯高于治療后的患者。數(shù)據(jù)顯示hsa_circ_0012919與CD70和CD11a表達(dá)呈正相關(guān)，與DNMT1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測hsa_circ_0012919可能與SLE的CD4+T細(xì)胞DNA甲基化異常有關(guān)。此研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0012919和miR-125a在細(xì)胞質(zhì)中共定位，表明hsa_circ_0012919與miR-125a結(jié)合，hsa_circ_0012919與狼瘡CD4+T細(xì)胞中miR-125a-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。一些學(xué)者證明了miR-125a可以調(diào)控RNATES和KLF13，而miR-125a-3p可以作為miR-125a的活性片段，因此推測hsa_circ_0012919通過miR-125a-3p來調(diào)控RNATES和KLF13。并發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0012919與狼瘡CD4+T細(xì)胞中RNATES和KLF13的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而miR-125a-3p降低了RNATES和KLF13的表達(dá)，hsa_circ_0012919逆轉(zhuǎn)并增加了RNATES和KLF13的表達(dá)。為了證明hsa_circ_0012919與miR-125之間存在直接關(guān)系，進(jìn)行了劑量依賴性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，RNATES和KLF13的表達(dá)呈劑量依賴性，受miR-125和hsa_circ_0012 919的影響[43]。以上結(jié)果表明hsa_circ_0012919可能通過miR-125a調(diào)控KLF13和RANTES。因此hsa_circ_0012919可作為SLE的生物標(biāo)記物，hsa_circ_0012919是miR-125a-3p的ceRNA。

2 circRNA與RA

RA是一種慢性全身性自身免疫疾病，其特征為慢性關(guān)節(jié)炎，主要損傷關(guān)節(jié)滑膜，導(dǎo)致關(guān)節(jié)進(jìn)行性損傷、殘疾和死亡[44]。其病因迄今為止尚不明確。環(huán)境因素、遺傳背景以及IL-27、IL-35、TNF-α等促炎因子已被證實(shí)與RA的發(fā)病有關(guān)[45,46]，circRNA可作為miRNA的分子海綿發(fā)揮其生物學(xué)功能調(diào)節(jié)RA的發(fā)病機(jī)制。circRNA在RA中的研究剛剛興起，其在RA的診斷和治療中都可能發(fā)揮重要作用。

最近報(bào)道，在RA患者與健康人的PBMC中，檢測到12個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中9個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào)[47]。circRNA微陣列分析和qRT-PCR驗(yàn)證鑒定出RA患者PBMC中的circRNA_092516、circ-RNA_003524、circRNA_103047、circRNA_104871和circRNA_101873表達(dá)與來自健康對照組呈顯著差異并上調(diào)，表明這些circRNA可能參與RA的發(fā)病。雖然，這些差異表達(dá)的circRNA與疾病活動(dòng)評分(DAS28)、紅細(xì)胞沉積率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和健康評估問卷(HAQ)無關(guān)，表明這些circRNA可能不是RA患者疾病嚴(yán)重性或全身性炎癥的相關(guān)生物標(biāo)志物，但這些circRNA的表達(dá)水平存在部分相關(guān)，例如circRNA_003524的表達(dá)水平與circRNA_103047相關(guān)。為了評估顯著差異表達(dá)的circRNA對RA診斷的潛在價(jià)值，Ouyang[47]進(jìn)行了ROC曲線分析。確認(rèn)的circRNA的ROC曲線顯示PBMC中circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873和circRNA_103047的水平可以將RA患者與健康對照組區(qū)分，并發(fā)現(xiàn)circRNA_104871的AUC值最高(AUC：0.833,95%CI 0.721-0.944，P<0.001)，因此，其顯示出最高的ROC AUC值，表明circRNA_104871具有診斷RA生物標(biāo)志物的高潛力。這些circRNA可能存在直接或間接相互作用，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

另有報(bào)道，與健康人比較，RA患者外周血血漿中circRNAs(如hsa_circ_0054189，hsa_circ_0008675，hsa_circ_0082689，hsa_circ_0082688，hsa_circ_0010932，hsa_circ_0002473和hsa_circ_0044235)的表達(dá)，只有hsa_circ_0044235顯著減少[48]，推測hsa_circ_0044235可能與RA有關(guān)，但其水平與類風(fēng)濕因子(RF)、抗膽堿蛋白抗體ACPA、 CRP、 ESR和DAS28無關(guān)，表明外周血中的hsa_circ_0044235可能不能用作RA中全身性炎癥或疾病活動(dòng)的標(biāo)志物。但該研究發(fā)現(xiàn)外周血hsa_circ_0044235的AUC高達(dá)0.779,基于外周血的hsa_circ_0044235風(fēng)險(xiǎn)評分表明，其表達(dá)水平可以有效地區(qū)分RA患者與SLE患者，提示外周血中的hsa_circ_0044235可以特異性識別RA患者，并且診斷準(zhǔn)確性更高。經(jīng)靶標(biāo)軟件預(yù)測，hsa_circ_0044235具有hsa-miR-892a、hsa-miR-135b-5p和hsa-miR-135a-5p三個(gè)miRNA靶標(biāo)，經(jīng)RA患者外周血檢測發(fā)現(xiàn)，僅has-miR-892a的表達(dá)水平顯著升高[48]。推測hsa_circ_0044235可能通過與hsa-miR-892a相互作用，參與RA發(fā)病，當(dāng)然需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)這一假設(shè)。

另有報(bào)道，通過提取RA患者和健康對照組PBMC的總RNA，并進(jìn)行circRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)RA患者的PBMC中的hsa_circ_0092285、hsa_circ_0058794水平顯著上調(diào)，而hsa_circ_0088088、hsa_circ_0038644水平則顯著下調(diào)。hsa_circ_0088088是RA中最顯著下調(diào)的circRNA，hsa-miR-16-5p是hsa_circ_0088088的miRNA反應(yīng)元件(MRE)之一，意味著hsa-miR-16-5p顯著增加；RA患者中，miR-16主要與疾病的活動(dòng)程度相關(guān)，例如ESR、CRP、關(guān)節(jié)壓痛計(jì)數(shù)(TJC)和TNF-α、DAS28等指標(biāo)呈正相關(guān)；因此可以推斷hsa_circ_0088088可能通過miR-16在RA的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[49]。盡管該研究未針對RA的病理生理和分子機(jī)制選擇和驗(yàn)證特定的circRNA，但該研究可能為RA的早期診斷和發(fā)病機(jī)理提供新的觀點(diǎn)，circRNA在RA的發(fā)展和進(jìn)程中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

3 展望

新近發(fā)現(xiàn)，SLE和RA患者血清和細(xì)胞中部分circRNAs的水平顯著上調(diào)或下調(diào)，其一方面可作為SLE和RA診斷或疾病活動(dòng)度判斷的新型生物標(biāo)志物，另一方面可通過與microRNA等靶標(biāo)相互作用，參與其發(fā)病，但其機(jī)制尚不完全清楚，仍需系統(tǒng)和深入地研究其具體表達(dá)和調(diào)控的分子機(jī)制?？傊?，靶向circRNA有望為SLE和RA的診斷及治療提供新思路。